克隆绿色荧光蛋白分子生物学实验报告资料下载.pdf
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例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用。
2.实验目的实验目的2.1.学习碱裂解法提取质粒的原理学习碱裂解法提取质粒的原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,具有双链闭环结构的DNA分子。
它具有自主复制能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。
目前,经人工改造的质粒已广泛用基因工程中目的基因的运载工具载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小,且具有超螺旋共价闭合环状的特点,从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。
现在常用的方法有:
碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。
实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。
其主要原理:
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
2.2.掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法:
是根据载体的遗传特征筛选重组子,如-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为-互补。
由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落,因而易于识别。
然而,当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选,又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后,有重组质粒的细菌形成白色菌落。
3.实验原理实验原理3.1.碱裂解法碱裂解法1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异;
2)高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA变性;
3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心形成沉定去除;
3.2.离心层析柱离心层析柱1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA;
2)去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;
3)低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱;
3.3.感受态细菌的制备(感受态细菌的制备(CaClCaCl22法)法)1)挑取一DH5单菌落于2.5mlLB培养液中37过夜培养2)取其中500l菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中,37振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间(旋转摇床200300r/min,培养液调零,每隔2030min测量)3)取50ml菌液置于离心管内,44500g离心5分钟4)加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液,摇荡重悬细胞,冰浴30分钟5)44500g离心5分钟收集细胞后,加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
6)感受态细胞分装成100l的小份,暂且不用的贮存于-70可保存半年。
取其中一份进行转化。
3.4.重组重组DNADNA的鉴定(酶切)的鉴定(酶切)1)质粒DNA三种构型:
1.共价闭环超螺旋2.线性3.开环的双链环状2)在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率:
3)共价闭环超螺旋DNA线性DNA开环的双链环状DNA3.5.琼脂糖凝胶电泳方法琼脂糖凝胶电泳方法1)凝胶准备称2g琼脂糖置三角瓶中,加0.5TBE200ml;
盖上牛皮纸,用橡皮筋捆紧微波炉加热n次,直至融解,1min/次,中高温(一般35次);
2)胶床准备将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内,梳齿底端和床面有1mm的间隙;
将胶床放在调整好的水平台上;
3)铺胶:
将冷却至60的凝胶加入20l荧光染料(有毒)倒入准备好的胶床内,凝胶厚度约5mm;
4.实验设备实验设备恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅5.实验材料及试剂实验材料及试剂5.1.试剂的配制试剂的配制LB培养基(液体、固体)Bioteke质粒提取试剂盒(北京百泰克,中国)S1;
50mmol/L葡萄糖25mmol/LTrisCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)2mg/mL溶菌酶S2;
0.2mol/LNaOH1%SDSS3:
5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml5.2.材料的处理材料的处理含pEGFP-N1质粒的大肠杆菌DH5a琼脂糖凝胶的制备上样:
每孔上一个样品,加样前,样品先与加样前,样品先与6上样缓冲液混匀上样缓冲液混匀(如预加有染料物质,可省如预加有染料物质,可省此步此步)电泳:
电压80120v;
2030min结果观察:
凝胶成像仪6.实验操作步骤实验操作步骤6.1.小实验一:
质粒提取6.2.小实验二小实验二取0.2mlPCR反应管一支,用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头):
PCR反应体系H2O6l质粒DNA(pEGFP-N1)2l引物GFP1(10M)1l引物GFP2(10M)1lPremixTaq10l总体积20l如配好的反应液较多沾到管壁上,可将PCR反应管置离心机中瞬时离心,使反应液集中于管底,然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上94预变性5分钟后开始以下循环9430秒5630秒30循环721分钟727分钟4保温实验过程约1小时50分钟琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶的制备上样:
每孔上一个样品,加样前,样品先与6上样缓冲液混匀(如预加有染料物质,可省此步)电泳:
凝胶成像仪6.3.小实验三感受态细菌制备和T连接连接反应体系连接反应体系实验组对照组即用型蓝白T载体1l1lPCR扩增产物ControlInsertDNA快速连接缓冲液(2X)1l-5l-1l5l超纯水-ddH2O2.5l2.5lRapidT4DNAligase0.5l0.5l总体积10l10l重组重组DNA的转化的转化感受态细菌制备感受态细菌制备1.挑取一DH5单菌落于2.5mlLB培养液中37过夜培养2.取其中500l菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中,37振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间(旋转摇床200300r/min,培养液调零,每隔2030min测量)3.取50ml菌液置于离心管内,44500g离心5分钟4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液,摇荡重悬细胞,冰浴30分钟5.44500g离心5分钟收集细胞后,加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成100l的小份,暂且不用的贮存于-70可保存半年。
6.4.小实验四:
重组DNA的鉴定(酶切)7.结果和计算结果和计算琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1:
用于检验质粒提取是否成功,如图的:
用于检验质粒提取是否成功,如图的13泳道,是我们小组完的泳道,是我们小组完的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳
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