东乡野生稻叶绿体基因组拼接及系统进化分析Word文件下载.docx

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高通量测序技术的快速发展，推动了植物叶绿体基因组的测序工作。

但传统

的叶绿体基因组测序方法需要建立在分离纯化叶绿体DNA的基础上，操作繁琐，

耗时较长。

为了优化叶绿体基因组DNA序列的获取和拼接方法，以东乡野生稻

（Oryzarufipogon）嫩绿10叶为材料，不需分离叶绿体DNA，利用高通量测序获

得的全基因组短序列（reads）及叶绿体基因组高度保守的特性，与参考序列进行

比对，从而组装拼接出叶绿体DNA序列，并同时利用生物信息学手段和PCR扩

增进行补洞。

最终获得东乡野生稻完整叶绿体基因组序列，大大小为134537bp，

（LSC）小、（SSC）单拷贝区和反向互补重复区（IR）大小分别为80585bp、

12346bp和20803bp，共注释叶绿体基因152个。

基于获取的东乡野生稻及其他叶

序列，通过构建进化树分析，结果显示在禾本绿体基因15组

科中水稻与麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）和黍亚科（Panicoideae）亲缘

关系最近，粳稻与中国普通野生稻的亲缘关系较近，粳稻与籼稻并非同时驯化出现。

关键词:

作物遗传学;

东乡野生稻;

叶绿体基因组;

高通量测序;

嫩绿叶中图分类

号:

S511.920AssemblyandphylogeneticanalysisofDongxiangwildricechloroplastgenomeLINZhangxiangWANGYingyingFUFeiYEChuyuFANLongjiang

DepartmentofAgronomyCollegeofAgricultureandBiotechnologyZhejiangKeyLaboratory25ofCropGermplasmZhejiangUniversityHangzhou310058ChinaAbstract:

Completechloroplastgenomesequenceisveryusefulforstudyingtheevolutionofspecies.Therapiddevelopmentofhigh-throughputsequencingtechnologypromotestheplantchloroplastgenomesequencing.FortraditionalchloroplastgenomesequencingmethoditisnecessarytoisolateandpurifythechloroplastDNAbeforesequencing.DuetolowconcentrationofchloroplastDNAitis30difficulttoseparateitfromnucleargenomeDNA.ThereforechloroplastDNAisolation-basedmethodistediousandtimeconsuming.ThisstudyemployedasimpleandrapidmethodforchloroplastgenomesequencesacquisitionwithoutisolationofchloroplastDNA.BasedonconservationofchloroplastgenomesthewholegenomeshortreadsgeneratedbyIlluminaHiseq2000weredirectlyusedtomapagainstchloroplastreferencegenomes.Subsequentlythealignedreadswerecollectedandfurtherdid35denovoassembly.FinallythechloroplastgenomesequenceofDongxiangwildricewasobtained.Thechloroplastgenomeis134537bpinsizeandhasatypicalquadripartitestructurewiththelargeLSC80585bpandsmallcopySSC12346bpregionsseparatedbytwocopiesofaninvertedrepeatIRs20803bpeachregion.Intotal152chloroplastgenesweresuccessfullyannotated.ThephylogenetictreeofDongxiangwildriceand14PoaceaechloroplastgenomesshowsthatDongxiangwildricehasa40closerrelationshipwithDendrocalamuslatiflorusandPanicoideae.FurthermorewebuildaphylogenetictreebasedonSNPsofDongxiangwildriceandother22Oryzachloroplastgenomes.Theresultillustratesthatindicahasacloserrelationshipwithwildrice-Iwhilejaponicaareclosertowildrice-IIIsuggestingthatindicaandjaponicaweredomesticatedduringdifferentperiodsKeywords:

cropgeneticsdonxiangwildricechloroplastgenomehigh-throughputsequencingfresh45greenleaf作者简介:

林张翔1991-女硕士生物信息学通信联系人:

樊龙江1965-男教授生物信

息学.E-mail:

-1-中国科技论文在线0引言叶绿体是具有半自主遗传体系的细胞器，是绿色植物进行光合作用的重要场所。

叶绿体基因组是独立于核基因组外的器官基因组，具有单独的转录和转运系统，平均大小介于50120,180kb，是一个环形的双链结构，其DNA序列高度保守1。

叶绿体基因组的大小远小于核基因组，但其在每个细胞的拷贝数介于1000,10000，叶绿体基因结构和序列为研究物种进化起源及不同物种之间的亲缘关系提供了重要的资源和信息。

高通量测序技术的快速发展，推动了植物叶绿体基因组的研究。

自1986年首次获得地钱（Marchantiapolymorpha）2和烟草（Nicotianatabacum）3的叶绿体基因组的完整序列以55来，叶绿体基因组数据库不断增加充实。

截至2013年8月9日，美国国家生物技术中心（TheNationalCenterforBiotechnology

Information，NCBI）的细胞器基因组数据库（OrganelleGenomeResources）（）共收录了来自不同植物的285条叶绿体基因组。

虽然越来越多的植物叶绿体基因组测序完成，但传统的方法需要首先分离纯化叶绿体60DNA，再对其进行高通量测序或桑格法测序。

而由于叶绿体基因组DNA含量低，难于和核基因组DNA分离，因此传统的方法难度较高并且耗时较长。

2009年，台湾科学家首次利用一种简便的基于PCR的方法，不用分离纯化叶绿体DNA，获得了麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）和绿竹（Bambusaoldhamii）4的叶绿体基因组，之后又用该方法获得了文心兰（Oncidium）5的叶绿体基因组序

国科学研究院65利用RocheGSFLX列。

随着第二代测序技术的发展，2010年中

测序平台从椰枣树（PhoenixdactyliferaL.）6全基因组测序数据中获得了其叶绿体基因组序列。

本研究以东乡野生稻（Oryzarufipogon）绿色嫩叶为材料，在前期开展东乡野生稻基因组研究基础上7，利用一种优化的叶绿体基因组DNA序列获取和拼接方法，获得了野生稻叶绿体基因组的完整序列，并据此序列进行了野生稻的系统进化分析。

1.材料与方法701.1材料与数据本实验以东乡野生稻（Oryzarufipogon）绿色鲜叶为研究材料。

材料由中国水稻研究所提供，其Illumian高通量测序数据来自本课题组前期研究结果7。

其它数据包括NCBI（）上公布的7条稻属不同种的叶绿体基因组序列（NC_017835、JN005833、NC_008155、NC_001320、NC_016927、NC_005973、GU592209），韩斌课题75组发布的关于栽培稻起源研究的部分数据（）8（ERX046456、ERX046479、ERX046720、ERX046828、ERX046846、ERX005522、ERX014265、ERX002911、ERX014455、ERX046332、ERX046915、ERX046902、ERX046903、ERX046905），以及羊茅（Festucaarundinacea;

NC_011713）、黑麦草（Loliumperenne;

NC_009950）、剪股颖（Agrostisstolonifera;

、NC_008591）大麦（Hordeumvulgare;

、NC_008590）小麦（Triticum80aestivum;

NC_002762）、绿竹（Bambusaoldhamii;

NC_012927）、短柄草（Brachypodiumdistachyon;

NC_011032）、麻竹（Dendrocalamuslatiflorus;

NC_013088）、柳枝稷（Panicumvirgatum;

、（Zeamays;

NC_015990）玉米、（Coixlacryma-jobi;

NC_001666）薏苡NC_013273）、甘蔗（Saccharumoffcinarum;

NC_006084）、高粱（Sorghumbicolor;

NC_008602）、禾本科早期分化物种（Anomochloamarantoidea;

NC_014062）等14个禾本科（Poaceae）不同属85的叶绿体基因组序列。

-2-中国科技论文在线1.2方

法1.2.1基因组文库构建及测序提取足量的东乡野生稻叶片DNA，用物理方法随机打断成不同长度的DNA片段，通