复方中药五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响Word格式文档下载.docx
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摘要:
目的观察五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响.方法小鼠免疫器官质量法观察五灵胶囊对免疫器官质量的影响;
溶血素测定法观察体液免疫功能;
E花结与脾抗体生成细胞试验观察细胞免疫功能;
以LPS+BCG诱导小鼠免疫性肝损伤观察五灵胶囊对一氧化氮(NO)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)的影响;
戊巴比妥钠诱导小鼠P450观察五灵胶囊对小鼠P450含量和睡眠时间的影响.结果五灵胶囊能使免疫小鼠E花结数、脾脏指数、胸腺指数和QHS增加,促进体内IgG与IgM释放,血清HCIgG与HCIgm水平上升.对免疫性肝损伤小鼠微粒体内NO五灵胶囊大剂量有促进作用,小剂量有抑制作用,对IL-2与IL-6影响不显著.戊巴比妥钠能诱导小鼠的P450含量增加,五灵胶囊并不影响P450含量,但却抑制P450对戊巴比妥钠的代谢,使睡眠时间延长.此外,五灵胶囊还能降低戊巴比妥钠诱导升高的谷胱苷肽S转移酶(GSH-ST).结论五灵胶囊是一种免疫增强剂,对体液免疫与细胞免疫均有促进作用,不诱导P450产生,但能抑制P450对戊巴比妥钠的代谢,对LPS诱导的细胞因子,五灵胶囊作用不显著,对微粒体内NO呈双向作用.
Keywords:
Wulingcapsule;
immunity;
hemolysins;
liver/in-juries
Abstract:
AIMToinvestigatetheeffectofWulingcapsuleonimmunefunctionofmice.METHODSTheinfluenceofWulingcapsuleontheweightyimmuneorganwasobservedbythemethodofimmuneorganweighty,thefunctionofhu-moralimmunebydetectionofhemolysin,andtheimpactofcellmediateimmunebybothtestrosetteformationandquan-titativehaemolysisofSRBC(QHS).Afterimmunologicalliverinjuryinmiceinducedbymicrolipopolysaccharide(LPS)andbacillicalmetteGuein(BCG),thecontentofIL-2andIL-6,andthecontentofnitricoxide(NO)ofhepaticmi-crosomes,weremeasured.ThecontentP450ofhepaticmicro-somesandsleeptimeofthemiceweredetectedbyinjectionofsodiumpentobarbital.RESULTSWulingcapsulewasanimmunityexcitationreagent,whichcouldincreasetheindexorganofspleenandthyme,therosetteformation,andelevat-edthelevelHcIgGandHcIgM.ThebigdosageofWulingcap-sulepromotedandsmalldosageinhibitedtheactiononNOofhepaticmicrosomes,anditdidnotexertmucheffectonIL-2andIL-6ofmiceimmuneliverinjuriesinducedbyLPS,wul-ingcapsuledidn’taddtothecontentofP450forhepaticmi-crosomebutprolongedsleeptimeinpentobarbitalmice,anditcouldreducetheglutasthine-s-transferase(GSH-ST)inmiceinducedbypentobarbitalaswell.CONCLUSIONWul-ingcapsulesareanimmunityenhancer,whichpromotecellu-larandhumoralimmunitywithout,increasingP450ofhepat-icmicrosomes.TheyhavenoeffectsonlivercytokineinducedbyLPS,andhavedoubleactiononNOofhepaticmicro-somes.
0引言
复方中药五灵胶囊具有疏肝健脾和活血的功能,治疗慢性肝炎有较好的疗效[1].以往研究表明,五灵胶囊对化学性与免疫性慢性肝损伤有良好的治疗效果[2,3].为了探讨五灵胶囊对慢性肝损伤的机制,我们观察了五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响.
1材料和方法
1.1材料五灵胶囊,由博爱制药有限责任公司提供(批号:
970510,981206,991116);
小牛血清(Gibco产品);
2-巯基乙醇,由天津化学试剂厂生产(批号:
910708);
一氧化氮(NO)、谷光苷肽S转移酶(GSH-ST)测试盒由南京建成生物工程研究所提供;
脂多糖(LPS),Sigma公司产品;
IL-2、IL-6测试盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供;
卡介苗(BCG)由卫生部成都生物制品研究所提供,用时取1支(10人份),用溶剂2mL溶解作为供试品液;
756紫外分光光度仪上海第三分析仪器厂生产.空白对照为蒸馏水,氢化泼尼松(prednisolone,PDS),上海第九制药厂生产(批号:
920311);
环磷酰胺,连云港恒瑞制药有限公司提供,批号(981225);
BALB/c雄性小白鼠60只,体质量(20±
2)g,豚鼠、绵羊红细胞、鸡红细胞(由第四军医大学实验动物中心提供,动物合格证号陕医动证字08~013号).
1.2方法
1.2.1免疫器官脏器指数测定BALB/c小鼠60只,按体质量随机分为6组,即正常组、模型组、PDS组和五灵胶囊三剂量组(1,2,4g&
#12539;
kg-1),小鼠置室温(22±
3)℃,湿度45%~65%的实验室适应环境3d后试验.试验之日正常组、模型组小鼠ig给予生理盐水20mL&
kg-1,五灵胶囊组小鼠分别ig给予五灵胶囊1,2,4g&
kg-1;
PDS组SC,PDS25mg&
kg-1,隔日1次;
同日除正常组外,其余5组小鼠分别ip50mol&
L-1绵羊红细胞(SRBC)0.5mL,免疫3d重复1次.各组每日给药1次,连续给药7d;
末次给药后小鼠禁食给水,次日小鼠眼眶取血,活杀取脾、胸腺称质量,结果以脾和胸腺指数表示(脏器指数=脏器质量/体质量×
1000).
1.2.2玫瑰E花结与QHS测定取以[1.2.1]实验组小鼠脾脏加Gsy’s缓冲液碾匀,稀释至8×
109&
L-1的细胞悬液,按文献[4]方法,显微镜下计数玫瑰E花结形成数;
取稀释为5×
L-1细胞数的脾细胞悬液0.5mL,依次加2g&
L-1SRBC和1∶10豚鼠血清各0.5mL,混匀,另设不加补体的对照管,置37℃水中温浴1h,450g离心5min,取上清液在A413nm处测定A值,SRBC定量溶血值(QHS)[4]依溶血素测定法计算含量.
1.2.3HcIgG与HcIgM的测定取[1.2.1]实验组小鼠血清各10μL,1份不作处理,1份加等量2-巯基乙醇,置37℃水中温浴30min,两份血清各加Gsy’s缓冲液至4mL.取2-巯基乙醇处理的血清稀释液0.5mL,加50g&
L-1SRBC0.5mL,充分混匀,再加羊抗小鼠IgG和补体各0.5mL;
空白管以0.5mLGsy’s缓冲液代替血清同法操作;
取未处理血清稀释液0.5mL,依次加入SRBC、补体、Gsy’S缓冲液各0.5mL同法操作;
3样品置37℃水中温浴1h,450g离心10min,取上清液在A540nm处测定A值.按文献[4]计算含量HcIgG=2-巯基乙醇处理血清的A值×
稀释倍数,HcIgM=未处理血清的A值×
稀释倍数.
1.2.4IL-2与IL-6的测定BALB/c雄性小鼠50只,体质量(20±
2)g,按体质量随机分成5组,正常组、模型组、环磷酰胺组和五灵胶囊1,0.5g&
kg-1组;
小鼠置室温(22±
3)℃、湿度45%~65%的实验室适应环境3d后试验,试验日正常组小鼠尾iv生理盐水0.1mL,余组小鼠尾ivBCG0.1mL,BCG注射6d后正常组小鼠尾iv生理盐水0.1mL,试验组小鼠尾ivLPS90μg,次日正常组小鼠腋窝SC生理盐水0.1mL,试验组小鼠注射完全佐剂0.1mL,同时正常组和模型组ig生理盐水10mL&
kg-1,环磷酰胺组ip环磷酰胺30mg&
kg-1,五灵胶囊组分别ig五灵胶囊1.0g&
kg-1和0.5g&
kg-1.给药6d,正常组ip生理盐水0.1mL,试验组ipLPS100μg,继续给药至12d,末次给药后,正常组小鼠尾iv生理盐水0.1mL,试验组小鼠尾ivLPS120μg,禁食给水,12h后活杀取肝组织用冰冷生理盐水冲洗,加TMS缓冲液置冰浴中匀化制得20g&
L-1肝匀浆,按文献[5]制备微粒体,4℃12216g离心30min,取上清3mL,加88mmol&
L-1氯化钙0.3mL,充分摇匀,4℃静置15min,12216g离心40min,弃上清,沉淀加0.3mol&
L-1磷酸缓冲液1mL碾匀作为微粒体供试品液.取供试品液0.5mL按硝酸还原酶法测定NO含量.在无菌状态下取小鼠脾脏碾磨,用1640完全培养液制成1×
L-1的悬液,加入24孔培养板,每孔1mL,再加ConA使其终浓度为5mg&
L-1,置37℃50.0mL&
L
-1CO2孵箱中培养48,72h,按文献[6]分别检测IL-2,IL-6的含量.
1.2.5睡眠时间与P450的测定BALB/c雄性小鼠40只,体质量(20±
2)g,按体质量随机分为4组,正常组、对照组和五灵胶囊1,2g&
kg
-1组;
3)℃、湿度45%~65%的实验室适应环境3d后试验,试验日先分别ig五灵胶囊1,2g&
kg-1,给药2h后,正常组ip生理盐水10mL&
kg-1,其余3组ip50mL&
L-1戊巴比妥钠溶液10mL&
kg-1,并观察记录小鼠的睡眠时间.连续重复试验3次,3d后小鼠禁食给水,12h后解剖取肝组织,用冰冷生理盐水冲洗,准确称取0.8g,加入冰冷的TMS(pH7.46)缓冲液制成200g&
L-1肝匀浆,4℃
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