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DNA/DNA印迹杂交——SouthernBlotting;
RNA/RNA印迹杂交-Northernblotting;
斑点印迹杂交和狭线印迹杂交;
菌落或噬菌斑杂交。
5、细菌转化的技术方法。
原生质体转化法、化学转化法、电穿孔法。
6、Sanger的双脱氧链终止法的技术路线?
利用了DNA聚合酶的两种特性:
第一,它能够利用单链的DNA做模板,合成出准确的DNA互补链;
第二,DNA聚合酶能够利用2’,3’-双脱氧核苷酸做底物,使之参入到寡核苷酸连的3’末端,从而终止链的生长。
技术路线:
见书
7.化学修饰法的技术路线:
见P71,参考技术图
8.PCR的原理:
双链DNA分子在高温下解链成两条单链DNA,然后DNA聚合酶在有一对寡核苷酸引物的存在的情况下,以单链DNA为模板利用反应混合物中的dNTPs合成新生的DNA互补链。
并且,每一条新生链上都具有了新的引物结合位点。
然后反应混合物再经过上述过程,即可有合成新链。
如此反复循环,即可实现特定区段DNA的迅速大量扩增。
9.简并引物:
一类由多种寡核苷酸组成的混合物,彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。
Taq聚合酶:
有5’3’DNA聚合酶活性;
无3’5’外切酶活性;
最适聚合酶温度72℃,连续保温30min具有相当活力,选择72℃延伸;
变性温度:
≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性。
Pfu聚合酶:
耐热;
有5’3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性;
精确度:
pfu>
Taq,但pfu扩增效率通常比Taq酶略差
反向PCR:
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
10.盒式取代诱变的原理:
利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相应序列。
这种寡核苷酸盒是由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出需要的粘性末端。
Kunkel定点诱变:
①将待突变的基因克隆入RF-M13DNA载体上,导入具有dUTP酶(dut-)和N-尿嘧啶脱糖苷酶(ung-)双缺陷的大肠杆菌(dut-,ung-)菌株中。
②dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP水平上升,并在DNA复制时,部分取代dTTP进入DNA新生链中。
又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。
由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代,然后进行DNA定点诱变。
③双链DNA导入正常的大肠杆菌中,其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。
结果原来的M13模板链被降解,只有突变链因不含U,被保留下来。
这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。
重组PCR定点诱变:
详见P98
11.凝胶阻滞实验原理:
DNA与蛋白质结合后分子量变大,改变了迁移率,由此判断DNA是否与蛋白质发生结合。
竞争DNA的作用:
反应体系中加入超量的非标记竞争DNA,用于研究DNA与蛋白质作用的专一性。
12.DNaseI印迹试验原理:
详见P115,参考技术图
13.甲基化干扰试验原理:
根据DMS(硫酸二甲酯)能够使G残基甲基化,而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。
第三章
1、限制性内切酶识别DNA的特点?
什么是同裂酶,什么是同尾酶?
Ⅰ型酶:
分子量较大,反应需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)、ATP等。
这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点,而且切割是随机的,所以在基因工程中应用不大;
Ⅱ型酶(狭义的限制性内切酶):
分子量较小(105Da),只有一种多肽,通常以同源二聚体的形式存在。
反应只需Mg2+的存在,并且具有以下两个特点,识别位点是一个回文对称结构,并且切割位点也在这一回文对称结构上。
许多Ⅱ型酶切割DNA后,可在DNA上形成粘性末端,有利于DNA片段的重组。
(1)基本特点
在DNA双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子,产生链的断裂。
两个单链断裂部位在DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相对的
因此,断裂的结果形成的DNA片断,也往往具有互补的单链延伸末端。
(2)识别顺序和酶切位点
①识别4-8个相连的核苷酸
②对称性
③限制酶切后产生两个末端,末端结构是5’-P和3’-OH
(3)末端种类
①3’-端突起,个数为2或4个核苷酸
②5’-端突起,个数为2或4个核苷酸
③
平齐末端
④非互补的粘性末端,切点在识别顺序之外的
Ⅲ型酶:
这类酶可识别特定碱基顺序,并在这一顺序的3’端24~26bp处切开DNA,所以它的切割位点也是没有特异性的。
同裂酶:
定义:
能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶
特点:
识别相同顺序,切割形成相同的末端
同尾酶:
来源各异,识别的靶序列不同,但产生相同的粘性末端
2、说明有哪些因素会影响内切酶活力的?
什么是星号活力?
1)DNA的纯度:
污染的蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制核酸内切酶活力。
(2)DNA的甲基化程:
基因克隆中采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。
(3)酶切消化的反应温度大多数核酸内切酶的反应温度在37℃,有些酶例外。
(4)DNA的分子结构:
DNA分子的不同结构对核酸内切酶的活性有很大影响
(5)核酸内切酶的缓冲液(-20℃保存)主要成分:
氯化镁、氯化钠、氯化钾,Tris-HCl,β-巯基乙醇,二硫苏糖醇(DTT)Mg2+:
酶发挥活性必需,不正确的Mg2+和NaCl会影响对特异序列的识别。
Tris-HCl:
保证酶反应的pH,一般在pH7.4条件下功能最佳巯基乙醇:
保持某些酶的稳定性;
甘油的影响(星号活性)
例:
EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC,但是如果甘油浓度超过5%(V/V),识别序列发生变化,可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割。
3、试举例说明什么是同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法?
见书上图。
4、什么是Klenow片段,如何进行DNA末端标记?
Klenow片段:
由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后,产生出来的分子量为76×
103dal的大片段分子。
仍具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’的外切酶活性,失去了全酶的5’→3’外切酶活性。
具有3’隐蔽末端的带标记得的DNA片断
5’GATCT…3’
3’A…5’
在反应物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道温育后生成:
3’*GA…5’
或是同时加入α-32p-dATP+dGTP
3’*AGA…5’
5、T4DNA取代合成法标记DNA的方法
⏹在反应过程中,通过T4DNA聚合作用,反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片段上原有的核苷酸,因此叫做取代合成。
⏹3’外切酶活力可以切割dsDNA和ssDNA,dsDNA>
ssDNA,要控制降解时间。
(图见书上)
6、反转录酶的作用方式
⏹α链具有聚合酶活性和RNaseH活性
⏹β链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性
7、T7DNA聚合酶的特点
⏹1978年,S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。
⏹加工形式的T7DNA聚合酶系:
T7噬菌体编码的基因5蛋白质,另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。
⏹基因5蛋白质:
具有聚合酶活性和3’→5’外切酶活性;
硫氧还蛋白:
增强基因5蛋白质与模板引物的结合力
⏹具有5’→3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’→5’核酸外切酶活性。
8、DNA末端转移酶的特点
⏹末端脱氧核苷酸转移酶,从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质,在二甲胂酸缓冲液中,能催化脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用,逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。
⏹不需要模板,可以用含有的3’-OHDNA片段为引物,在3’-OH端加入核苷酸达几百个。
⏹它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA,平末端不是有效底物,如果用Co代替Mg做为辅助因子,可以成为有效底物。
9、碱性磷酸酶的作用
⏹来自于大肠杆菌或小牛肠,该酶用于脱去DNA(RNA)5’末端的磷酸基团,使5’-P成为5’-OH,该过程称核酸分子的脱磷酸作用。
当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接(或环化)时可进行脱磷酸反应。
10、T4多核苷酸激酶特点
T4多核苷酸激酶:
由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质,最初从T4噬菌体感染的E.coli中分离出来。
⏹作用:
催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端,不受底物分子链的长短限制。
⏹正向反应(forwardreaction)碱性磷酸酶处理DNA的5’端使其脱磷酸暴露出5’-OH,多核苷酸激酶将γ-32P-ATP的γ-32P转移到5’-OH,实现末端标记。
11、简述一种核酸内切酶和一种核酸外切酶的作用特点
外切酶III(ExoIII)——dsDNA
1、一般特点:
来自于E.coli,分子量28,000kD
2、催化反应类型
(1)外切酶活性:
3’→5’,产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA,pH7.6-8.5,外切酶活性特点①反应底物:
互补ds-DNA②碱基释放速度:
C>
>
A~T>
G③反应产物:
5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA,过渡反应将导致DNA降解
(2)核酸酶H活性:
除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子,pH7.6-8.5
(3)3’-磷酸酶活性:
除去3’-磷酸基后形成3’-OH端,有利于DNA聚合酶反应,pH6.8-7.4
(4)内切酶活性:
在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开,pH7.6-8.5
内切酶见第一题。
第4章基因克隆的质粒载体
1.什么是载体(vector)?
答:
载体(vector)是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分,通过实验手段可使其它的DNA片段连接在它的上面,进行复制。
2、作为基因工程的载体,必须具备哪些性能?
质粒载体必须具备的基本条件是什么?
作为基因工程的载体,必须具备以下性能:
1、分子较小,可携带比较大的DNA片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点,但每一种限制酶又要最少的切割位点(多克隆位点multiplecloningsites,MCS)。
4、有适合的标记,易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达,并且尽可
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