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荧光检测温习题参考答案
荧光检测在医学实验中的应用–温习题
第一章总论荧光的发生及大体检测原理
1何谓发光?
分子吸收辐射被激发后以光的形式释放,辐射跃迁而衰变回到电子基态→发光
2荧光与磷光的区别?
荧光:
激发后马上发光,第一电子激发单重态辐射跃迁;延迟10-9~10-7秒后。
基态S0→单重态S一、S2跃迁→基态。
磷光:
延迟时刻长,几毫秒或更长10-3~10秒电子自旋未配对进入受激三重态,三重态→跃迁→基态
3完成良好荧光检测的有关条件?
1)选择相应的激发波长2)选择足够强度的激发光源,荧光强度与入射光强度成正比If=φfI0(1-It/I0);3)选择适合(QE)的发射波长检测器件;4)操纵好样品制备与检测环境体系。
4荧光的种类
依照激发方式。
1)光化发光2)化学荧光3)生物荧光。
按荧光素的标记进程可分为:
1)免疫荧光2)组织荧光3)诱导荧光
5有哪几种荧光现象?
I次荧光现象:
固有或自发荧光;一经辐射就可发出荧光的物质。
II次荧光现象及荧光色素(标记物)又称继发荧光;样品分子不能或只能发出很弱的荧光,对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去,依照荧光探针的荧光分析大分子。
6阻碍荧光强度(If)的因素
1光化分解:
荧光物质吸收光能后,某些键断裂,致使荧光弱。
制片时应避光。
2荧光淬灭:
(1)温度淬灭:
加速震动弛豫而丧失振动能量;增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。
温度适宜或低温。
(2)浓度淬灭:
浓度大时发光分子在样品中散布不均,深部的分子吸收不到光子,量子产额反而小。
生成二聚体或多聚体,改变吸收光谱,If降低。
(3)杂质淬灭:
静态淬灭,杂质与荧光分子组成另一种化合物。
环境净化。
碰撞、转入三重态淬灭。
3pH阻碍:
破坏荧光物质环链结构,芳香族化合物的酸、碱功能团对pH灵敏。
7半波宽概念:
最大透光度Tmax波长1/2处对应的两波长差(λ1-λ2)也称带宽(Bandwidth),带宽窄那么光色纯。
第二章荧光成像检测
1光学显微镜分辨率概念及简易计算公式
2阻碍光学显微镜分辨率的要紧因素?
阻碍分辨率的因素为衍射效应:
圆斑像AIRY斑,阻碍分辨率。
3聚光镜与物镜孔径光阑的对应调剂?
目的:
产生与物镜相应的光束,使镜像的反差和焦深处于最正确状态。
不同倍率物镜有不同的NA值,改换物镜聚光镜NA应做相应调剂。
观看:
与物镜NA一致(100%),以取得较好的分辨率;照像:
相当于物镜NA的60~80%,以取得较好的反差、焦深。
4光学显微镜的有效放大=所用物镜NA值的500~1000倍
5荧光量子效率(QE)
荧光量子效(产)率=放射量子数/吸收量子数
6医学实验中荧光检测经常使用的荧光检测传感器是哪两种?
1转换光学信号为电子信号-光学传感器,2彩色CCD
7显微镜照相术的概念?
将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术
8阻碍CCD成像成效的要紧因素是什么?
温度和灵敏度,CCD工作时,表面会产生热量,使得在芯片形成暗电流,暗潮将增加噪音、降低信噪比、致使降低成像质量。
9CCD成像放大倍率的计算公式
显示或照片倍率=OBJ倍率×光学适配器倍率×显示或照片对角线长度/CCD对角线长度
10荧光显微镜CCD成像与激光共焦显微镜成像的比较
数字CCD优势:
价低,利用简便,成像块,测得FI同LSCM,彩色还原好,图像近于镜下,光化淬灭损害小。
Ratio测钙、利用TC板,适于标本:
薄、层次简单。
缺点:
厚标本图像质量差,无光切功能,整合功能配置价钱不菲
激光共焦扫描显微镜,优势:
分辨率高,光切片,3D空间立体结构观测,集成荧光分析功能。
缺点:
本钱高(专人、耗材),光化淬灭损害较大
11免疫荧光染色的目的
将抗体标记上荧光素(如FITC、TRITC),与细胞内相应抗原(目标蛋白)结合后,通过观看、检测具有特点性的荧光,定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白
12.免疫荧光染色经常使用方式
直接法、间接法和双标记法
13.阻碍免疫荧光染色结果的要紧因素有
1)荧光染料标记的抗体的浓度,2)溶液的pH值,3)溶剂
14.举例说明自发荧光要紧包括哪些
动物中一样为黄素类和卟啉类,植物中为叶绿素容易产生自发荧光。
脂褐素的自发荧光,弹力蛋白和胶原UV激发下呈黄绿色荧光,培育死细胞很容易产生自发荧光。
15.免疫荧光染色前对细胞接种密度的要求
细胞密度:
依如实验目的调整细胞接种密度。
对细胞个体进行形态学观看和定位荧光信号:
细胞密度稍稀疏。
使细胞充分伸展,显示出其应有的形态和结构;但也要注意保证视野内有必然数量的细胞,以便选取有代表性的细胞采图,要求细胞所占面积不低于视野的20%。
定量测定荧光强度(观看某种蛋白的表达量):
细胞密度应稍高。
用于做大量细胞的统计定量,细胞至少要占到视野面积的80%;这时细胞要布满视野但彼此之间还有间隙,细胞排列均匀,不聚堆拥堵,避免细胞间挤压变形,阻碍定量结果。
达到通常所说的亚融合状态。
16荧光显微镜观看免疫荧光染色需要设置的对照及意义
正确设置对照组(超级必要):
1.阳性对照:
已知抗原阳性的样品与待测样品同时进行免疫荧光染色,对照样品呈阳性结果,用于查验免疫荧光染色全进程是不是符合要求,包括孵育温度、时刻,一抗、二抗是不是有问题,分析可能缘故。
若是阳性对照呈阴性,那么说明实验进程有问题,需要对每一个条件加以分析改良。
2.阴性对照:
已知抗原阴性的样品作对照,对照样品应呈阴性结果。
包括空白对照(PBS代替一抗)和替代对照(非免疫血清朝替一抗),用于排除非特异性染色。
若是阴性对照呈阳性表达,一样检测样品的结果也是不可信的。
3.不染色细胞空白组:
不经免疫荧光染色,直接上机观看,用于检测由于细胞本身或固定造成的细胞自发荧光。
17共聚焦扫描显微镜(LCSM)光学成像原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点,使聚焦平面之外被激发的荧光不能进入检测针孔--高分辨率的光学切片
18共聚焦扫描显微镜(LSCM)与传统荧光显微镜比较的优势
1)提高了灵敏性及分辨率,2)扩大获取信息范围,3)实现了图像三维重建,4)客观记录荧光信息,5)同时显示多种标记物
19.概念:
荧光漂白恢复(FRAP):
经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被破坏,荧光强度下降,但此处荧光强度会渐渐恢复,荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速度,或分子运动速度。
20.概念:
荧光共振能量转移(FRET):
受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递,使后者被激发,这一进程称荧光能量共振转移。
能量的提供者叫供体荧光素,能量的同意者叫受体荧光素。
第三章荧光光度检测
1荧光分光光度计的构造示用意
光源→激发单色器→样品杯→发射单色器→检测器→电子放大及操纵→显示
2微孔板荧光检测在医学实验的应用
1)利用报告基因检测目标基因的表达:
将报告基因引入细胞DNA使之与某一特定分子事件相关,能够为这一分子事件带来可测性。
通常检测的分子事件是基因功能,具有可测性的是发光。
目前,市场上有许多发光报告基因出售。
包括:
萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase),β-半乳糖苷酶(B-galactosidase)等。
2)ATP水平测定:
所有活细胞都含有ATP。
ATP能够从细胞中提掏出来,用萤火虫荧光素酶检测。
荧光强度与样品中ATP的含量成比例,相应的与提取ATP所用的细胞数成比例。
能够检测样品中的所有微生物,因此被用于检测水中的大肠杆菌含量,用于药品,化妆品,牛奶和其它食物的微生物操纵,测定土壤和沉积物中的全数活生物含量,评判抗生素对微生物生长的阻碍,了解不同药物对哺乳动物细胞的阻碍等。
3)离子测定:
如细胞内钙离子测定。
3活细胞内钙离子浓度测定的方式
即从测量出的荧光信号中定量地计算出钙离子浓度。
关于单波长激发或发射的荧光指示剂,可按下式计算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F),Kd:
荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数,Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。
关于双波长的荧光指示剂,用率比值信号来计算细胞内游离Ca2+浓度,用下式计算细胞内游离Ca2+浓度,[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(R一Rmin)/(Rmax一R)Kd:
荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数.Fd和Fs别离表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时的荧光强度.,R为实验观看到的荧光比值.
Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值.,Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值.
4fura2指示剂测钙原理
Fura2:
由紫外激发的一种率测量指示剂,因有较强的亲水性,难以进入细胞,在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AM后,与细胞温孵时很容易透过细胞膜,胞浆内的酯酶可将Fura-2/AM水解成Fura-2而滞留在胞浆内,后者与胞内游离的钙离子结合形成Fura-2-钙离子复合物。
当Fura-2与Ca2+结合后吸收峰发生改变,在最大和最小Ca2+浓度时,它的最大吸收峰别离在335nm和363nm处,在作率测量时,常常选用的波长是340nm和380nm;结合钙和游离钙形式Fura2的发射峰都是510nm,其发射光的强度与钙离子的浓度呈比例关系
第四章荧光细胞激活分选、分析
1简述流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪的工作原理:
将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光染色后由气压装置送入流动室,流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当二者压力差达到必然程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区。
经激光束激发,产生散射光和荧光信号。
通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。
散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送运算机处置,可在运算机上直观地统计染上各类荧光染料的细胞各自的百分率。
2简述流式细胞仪的构造
1)流动室及液流驱动系统2)激光光源及光束成形系统3)光学系统4)信号检测与存贮、显示、分析系统5)细胞分选系统
3前向角散射概念(FSC,ForwardScatter)
前向角散射(FSC,ForwardScatter):
0°散射,与被测细胞的大小和面积有关,确切说与细胞直径的平方紧密相关,通常在FCM应用中,选取FSC作阈值,来排除样品中的各类碎片及鞘液中的小颗粒,以幸免对被测细胞干扰。
4侧向角散射概念(SSC,SideScatter)
侧向角散射(SSC,SideScatter):
90°散射,对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为灵敏,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
5试述AnnexinV/PI染色应用流式细胞仪检测细胞凋亡的大体原理
大体原理:
细胞凋亡初期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。
PS是一种带负电荷的磷脂,正常要紧存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂散布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。
AnnexinV是一种Ca2+依托的磷脂结合蛋白,具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。
该蛋白可充当灵敏的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
6简述PI(碘化丙啶)染色时显现细胞凋亡峰的原理
在凋亡细胞内,由于细胞核的解聚和凋亡小体的形成,核内的总DNA含量下降。
由于在凋亡细胞内DNA含量下降,在G1峰前显现亚二倍体峰,称亚G1期峰,又称凋亡细胞峰。
7试述PI(碘化丙啶)染色应用流式细胞仪检测细胞周期的原理
碘化丙啶是一种双链DNA的荧光染料,能够和DNA结合,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍
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