虹彩病毒生物学研究现状及展望_精品文档资料下载.pdf
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A文章编号:
100727995(2004)62007420620世纪80年代以来,我国水产业迅速发展,在农业产值中所占的比重逐年上升,已成为我国大农业的四大支柱产业(粮食、肉类、水产和禽蛋)之一。
2001年我国水产品年产量已达4380万t,2002年达4513万t,连续几年居世界第一位。
但令人遗憾的是水生动物疾病,尤其是因病毒引起的爆发性流行病明显增多,危害极为严重14。
自从Wolf等5分离到第一株鱼类病毒以来,迄今见报道的鱼类病毒已超过70种,这些病毒分别属于18个科2。
在报道的病毒中,虹彩病毒是一种危害较为普遍的病毒。
虹彩病毒科有4个属,它们分别是蛙病毒属(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、脊椎动物虹彩病毒属(Iridovirus)和绿虹彩病毒属(Chloriridovirus),其中后两个属主要感染昆虫,而前两个属的虹彩病毒则可感染多种水生经济动物并呈全球分布6,7。
1生物学性状虹彩病毒是一群大型的胞浆型DNA病毒,平面观察为六角形,二十面体对称,病毒粒子直径为120240nm,个别成员的直径甚至可达300nm。
虹彩病毒在提纯、浓缩或结晶后,在斜射光线照射下呈现蓝或紫的虹彩,因此被命名为虹彩病毒。
虹彩病毒含有单分子的双股DNA,相对分子质量为130106,G+C比例为29%32%(但鲑3型病毒的G+C比例最高可达58%)。
核酸重量占病毒粒子总重量的15%左右8,9。
应用超薄切片做电子显微镜检查,可见病毒粒子堆集于胞浆中。
病毒中心是一个电子密度高的类核体(核心),类核体的直径约7090nm,周围为一个清晰的六角形外壳。
病毒粒子在由宿主细胞的胞浆膜出芽而逸出时,获得外层膜囊。
病毒的抵抗力较大,感染培养物于23可以存活几个月,并能耐受反复的冻融处理。
置于-20以下保存,病毒可存活20个月,虹彩病毒对乙醚或氯仿等脂溶性溶剂敏感,不能保存于w为50%的甘油中。
1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
/2致病性和免疫性2.1致病性病毒对于机体的损伤,一是直接作用于宿主细胞,二是通过引发免疫应答异常而使宿主细胞损伤8。
2.1.1病毒感染对宿主细胞的影响病毒浸染宿主后,能够在宿主细胞内编码产生一些酶类物质,抑制宿主细胞的核酸复制和蛋白质合成,细胞因正常代谢受阻而死亡。
病毒还能使细胞溶酶体膜破坏,溶酶体的酶外溢,从而使细胞自溶。
随着病毒大量复制,导致细胞裂解,释放大量病毒粒子,又去感染更多细胞。
最终导致机体的功能衰退,引起死亡。
有些病毒感染了细胞后,并不立即导致细胞死亡,而是使细胞膜的结构和功能发生变化,将相邻的细胞融合成多核巨细胞,或引起机体发生免疫反应。
有些病毒感染细胞后,在细胞浆或细胞核内产生圆形或椭圆形的斑块状包涵体9。
2.1.2免疫应答对细胞的损伤机体产生的抗病毒抗体与细胞膜上的病毒抗原结合后,能够引发机体依赖性细胞毒作用或抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。
病毒感染能够改变宿主细胞表面成分形成自身抗原,导致自身免疫应答而造成组织细胞损伤。
在虹彩病毒的自然暴发中,发病大多突然。
潜伏期一般为515d,最高死亡率可达100%。
这类病毒能引起鳖、龟、牛蛙、蟾蜍、日本鳗鲡、鲈鱼、牙鲆、真鲷、鲶鱼、大菱鲆、石斑鱼和鲍鱼等近百种水生动物发病,使欧洲、亚洲、美洲、澳洲等地的养殖及观赏水生动物死亡率达到30%100%,危害极大4,1013。
感染的病鱼一般体色发黑,鳃部呈贫血状态,体表和鳍出血,病鱼肝脏、脾脏、头肾等处增生肿大,脾脏组织切片能观察到异常肥大细胞,这些细胞中含有病毒粒子。
2.2免疫性虹彩病毒是一种颇为独特的病毒,大多数病毒株的毒力很强,但免疫原性甚低。
虽然动物在感染后721d内经常产生补体结合性抗体、沉淀抗体和红细胞吸附抑制抗体,但无论是自然感染还是人工感染,都难发现有中和抗体的存在。
不过感染过虹彩病毒的水生生物,常能抵抗同类型毒株的攻击。
因此,一般认为,患过虹彩病毒的水生生物对再感染的抵抗力,可能是产生一种干扰素样物质的缘故14。
由于虹彩病毒的多样性,疫苗接种的效果一般都不理想。
近期日本和我国的部分地区应用弱毒疫苗进行预防注射。
虽然接种疫苗能产生高价抗体,但是并不经常出现良好的免疫保护力。
因此,关于虹彩病毒的疫苗的研制,目前尚不是十分成功。
特别是弱毒疫苗的大量使用,病毒广泛散布,在一定程度上出现了许多健康带毒个体3,15。
3检测与诊断虹彩病毒病在自然界暴发时大多数很突然,一旦发病,将难以治疗。
因此,及早发现和确诊水生动物是否被虹彩病毒感染,并采取相应措施防止该病继续扩散,是生产中减少损失最有效的途径16。
常用的方法很多,可简要归纳为下述几类:
3.1电镜观察电镜用于水生动物病毒的研究,其视野并不局限于观察细胞病变、病毒的形态大小和分类,已扩展到用于了解病毒的感染和复制机理、病毒的形态发生等。
病毒囊膜的有无是水生动57第3期王广军:
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/物病毒的基本结构及分类特征之一,对此,电镜观察能提供直接证据,如通过电镜观察发现,斑节对虾杆状病毒是以有囊膜和无囊膜两种形式存在,它们的结构多肽有差异,密度也不同,可通过密度梯度离心将它们分离。
详细观察牛蛙病毒(RGV)的吸附、入侵、脱壳、复制与装配等全部增殖过程也是借助电镜完成的17。
陈在贤等13用电镜观察从患“红脖子病”甲鱼体上分离到病毒,初步定为虹彩病毒。
姜明等18用电子显微镜对一种真鲷球形病毒的形态及细胞病理学进行了观察。
通过电镜可以观察到患虹彩病毒病的大菱鲆鳍、鳃、肾、脾、肝、胰、心及脑组织中虹彩病毒病原,从而进行初步确诊19。
徐洪涛等20利用电镜观察到患病牙鲆病变组织内存在大量六角形对称病毒颗粒,有包膜,完整病毒粒直径为210nm,结合聚合酶链反应(PCR)技术确定为虹彩病毒。
3.2细胞培养细胞培养技术是病毒学研究的基础,也是病毒病诊断的经典方法之一。
当然,不同病毒的敏感宿主细胞有可能不同。
因此,在试图通过细胞培养的方法鉴定和分离病毒时,需事先了解某种细胞对该种病毒的敏感性。
国外已有利用培养细胞研究淋巴囊肿病毒(虹彩病毒科的一种)等虹彩病毒的报道2124。
国内张奇亚等25通过建立了呈上皮细胞形态的草鱼椎骨间质细胞系GCVB,表明GCVB细胞对蛙虹彩病毒中国分离株RGV9506及蛙虹彩病毒美国分离株FV3敏感,可引起不同程度的病变。
孙修勤等26、吕宏旭等27分别利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养。
3.3生物技术应用建立敏感可靠的方法,以用于病毒病原的检测,对于控制水生动物病毒病的流行具有积极意义21。
目前,新兴的生物技术在人类和其他动物疾病防治中的应用,为水生动物疾病的防治提供了新的思路和手段。
3.3.1免疫酶技术免疫酶技术是当前广泛采用的免疫检测技术,特别适用于快速检测。
酶联免疫吸附实验(Elisa)是利用抗原或抗体能非特异性地吸附于聚苯乙烯等固相载体的表面性质,使抗原抗体反应在固相载体表面进行。
包括间接法、双抗体夹心法等。
海水鱼的虹彩病毒、传染性胰脏坏死病毒和传染性造血组织坏死病毒等多种病原微生物都成功地利用Elisa法进行了检测28。
3.3.2聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)是一项DNA在体外合成的放大技术。
根据PCR原理,人们发展出多种不同的PCR技术,一些技术已经成功运用于检测细菌和病毒。
邓敏等29根据真鲷虹彩病毒(RSIV)核甘酸还原酶小亚单位(RNRS)基因的高度保守区探索性地设计并合成一对引物,报道了鳜鱼病毒的PCR检测方法,可检测到0.1pg病毒DNA。
苗素英等30用PCR方法检测到虎纹蛙病毒中有虹彩病毒的存在。
徐洪涛等20用PCR技术与电镜观察相结合,证明引起牙鲆疾病的病原为虹彩病毒。
吕玲等31对一种蛙病毒酶切、PCR扩增后,通过比较酶切图谱、PCR扩增产物,证明该病毒为蛙虹彩病毒属的一种。
4虹彩病毒病的防治方法虹彩病毒能引起鲈脾肿大症、石首鱼暴发性传染病、真鲷虹彩病毒病、牙鲆淋巴囊肿病、石斑鱼慵懒病、甲鱼“红脖子病”等近百种水生动物疾病,死亡率高达30%100%,危害性极大4,1013。
与其他病毒性疾病一样,对于彩虹病毒病,目前尚无特效药3,28,32,唯以预防为主:
一是提高67湛江海洋大学学报第24卷1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http:
/鱼类机体自身免疫能力;
二是减少水环境中病毒的存在,降低病毒感染鱼体的机会。
此外,筛选或通过细胞工程、基因工程培育抗病品种是进行病毒性疾病防治的有效途径之一。
灭活疫苗、减毒疫苗、细胞工程疫苗等对草鱼出血病的防治作出了重要贡献,然而,在虹彩病毒病的防治中,疫苗的制备与病毒病的防治尚处于经典方法的试验阶段,还有大量研究工作有待展开。
5虹彩病毒病的研究展望虹彩病毒病的危害较大,且在全世界水生动物中广泛流行2,4,11,因此,国内外学者也进行了广泛而深入的研究,主要集中在以下几个方面33。
1)鱼和蛙虹彩病毒的比较研究。
对从澳洲、北美、南美、东南亚及欧洲收集的数十种虹彩病毒病,分别通过血清学交叉反应、超微病理学观察、限制性内切酶作用、PCR产物测定、分子杂交及DNA测序等研究,显示它们绝大多数是虹彩病毒属成员34。
2)虹彩病毒基因组及基因的测序研究。
在GeneBank中登录的虹彩病毒基因或基因片段已超过百个,但迄今只获得5株病毒的基因组全序列。
所测到的蛙虹彩病毒序列不到其全长的1/10。
目前我国在GeneBank中有虹彩病毒基因登录号的单位有中科院水生生物研究所、中山大学31,35,但登录的基因片段的总数不超过10个。
3)虹彩病毒基因与细胞基因的同源性研究。
虹彩病毒属于大的胞质DNA病毒,在与其他真核生物大的胞质DNA病毒进行比较时发现,虹彩病毒与宿主细胞的某些基因有遗传相似性,这些同源性基因编码并转录、复制与核酸代谢相关的酶类。
这一认识将对了解病毒的起源、系统发育树的构建很有帮助。
目前对虹彩病毒还没有十分有效的防治方法,但近年来相继问世的亚单位疫苗、合成疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗已在人类病毒病防治中得到应用,这为水生动物病毒病的免疫治疗提供了借鉴36。
单克隆抗体作为新的高效免疫制剂,具有较强的研制、开发、使用的前景。
利用基因转移技术,将表达某种抗原的基因导入体内,通过抗原基因的表达,诱导保护性抗体,刺激机体产生抗病毒免疫反应。
这些都会为虹彩病毒的防治产生积极的影响。
特别是日本,近几年一直尝试研制虹彩病毒的疫苗,目前正和珠江水产研究所合作,在珠江水产研究所海南基地对高体、美国红鱼进行探索性实验,并取得了初步的成果。
下一步的工作重点是对该技术的进一步完善。
同时,与机体水平研究病毒性疾病感染机制相比,细胞水平有其优越性,即有细胞的同质性、培条件的可控性、病毒感染的单一性、测定技术的
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