SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒说明书生工_精品文档资料下载.pdf
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SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒说明书生工_精品文档资料下载.pdf
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该试剂盒采用特殊的吸附膜,能够有选择性地吸附核酸分子,去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTP等,得到高质量的DNA纯化产物,可直接用于酶切、测序等后续的分子生物学试验。
本试剂盒具有以下特点:
1.适用范围广,回收效率高,对于100bp10kb之间的DNA片段回收效率在90%以上。
2.操作简单快速,整个回收过程仅须5分钟左右。
3.洗脱效率高,洗脱体积最小可低至15l。
快速操作流程(快速操作流程(PCR产物纯化)产物纯化)1.准备工作。
a.检查WashSolution中是否已加入乙醇。
b.检查BufferB3中是否已加入异丙醇。
c.检查BufferB3是否出现沉淀。
2.在PCR反应液中加入5倍体积的BufferB3,充分混匀。
3.8,000g离心30秒。
倒掉收集管中液体。
4.加入500lWashSolution,9,000g离心30秒,倒掉收集管中液体。
5.重复步骤4一次。
6.空柱于9,000g离心1分钟。
7.将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中,在吸附膜中央加入15-40lElutionBuffer,室温静置1分钟后,离心1分钟。
保存管中DNA溶液。
收集上柱洗涤洗脱收集上柱洗涤洗脱试剂准备试剂准备1.自备材料:
水浴锅、小型高速离心机(最大离心力12,000g)、1.5ml离心管、无水乙醇、异丙醇等。
2.按瓶身标签说明在WashSolution中加入相应量的无水乙醇(乙醇终浓度为80%),混匀后在瓶身做好标记。
密封于室温保存。
3.按瓶身标签说明在BufferB3中加入相应量的异丙醇(异丙醇终浓度为20%),混匀后在瓶身做好标记。
4.BufferB3在低温下可能产生沉淀,使用前请检查,如有沉淀,请于37C溶解沉淀,待冷却至室温后使用。
标准纯化步骤标准纯化步骤1.将PCR反应液或酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中,加入3倍体积的BufferB3,充分混匀。
首次使用前请先检查是否已加入适量的异丙醇。
若反应液体积过小,可用TE或水补足至100l,然后再加入300lBufferB3。
2.将混合液全部移入吸附柱,8,000g离心30sec。
倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。
如果体系总体积大于750l,则每次使用750l,多次上柱。
将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱,可以进一步提高DNA回收率。
3.向吸附柱中加入500lWashSolution,9,000g离心30sec。
WashSolution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。
4.重复步骤3一次。
5.将空吸附柱和收集管放入离心机,9,000g离心1min。
此步绝不可省略,否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
6.在吸附膜中央加入1540lElutionBuffer,室温静置12min,9,000g离心1min。
将所得到的DNA溶液置于-20C保存或用于后续试验。
ElutionBuffer为2.5mMTris-HCl,pH8.5,可以用TE或水(pH7.0)代替。
将ElutionBuffer预热至60C可以进一步提高得率。
如果片段4kb,在3760C温浴2分钟可以显著提高得率。
请勿使用小于15l的洗脱液进行洗脱。
常见问题解答常见问题解答1.PCR产物回收效率较低或者未回收到目的片段a.WashSolution中未加入正确量的无水乙醇。
b.提高BufferB3的相对浓度,增加DNA与吸附膜的作用时间(静置时间),在一定程度上可以提高回收率。
c.如果纯化的片段长度大于4kb或者目的片段含量较少,可将洗脱液再次加入吸附柱进行洗脱,以提高回收效率。
d.洗脱液加入位置不正确。
洗脱液应加在硅胶膜的中心部位,以完全覆盖硅胶膜的表面,达到最大的洗脱效率。
e.洗脱液不合适。
洗脱缓冲液的pH值对洗脱效率有影响,如果使用水进行洗脱,请确保其pH值7.0,pH值过低可能导致低洗脱效率。
f.洗脱时将洗脱液预热至60C后使用,有利于提高洗脱效率。
g.洗脱时间过短。
洗脱时间对回收率也有影响。
洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。
2.回收的PCR产物进行后续酶切或者连接效率低a.若洗脱产物中含有残留的乙醇会影响酶切。
可将空柱离心后的吸附柱开盖室温晾干25分钟,有助于残留的酒精挥发完全。
b.盐份的残留。
请确保使用WashSolution冲洗两次,每次500l沿管壁加入,有助于彻底去除管壁上的盐份。
c.回收后的PCR产物在反复冻溶的情况下,会加速末端A和整个PCR产物的断裂,从而造成与T载体连接或直接酶切效率的下降。
建议回收后立即进行酶切或连接实验。
d.选择合适的PCR产物和T载体的分子数比例,有助于提高连接效率.e.请确保PCR最后72C510分钟的延伸时间,这样才有足够的PCR产物在末段带有A附加碱基,保证较高的连接效率。
3.回收的片段为什么电泳上样会漂起来?
主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。
可将离心后的吸附柱开盖室温干燥25分钟,有助于残留的酒精挥发完全。
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