实时荧光定量PCR检测临床上的运用与意义_精品文档资料下载.pdf
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HPV;
MTB;
AbstractAbstractObjectiveusingreal-timefluorescencequantitativePCRmethodinclinicaldetectionofeachproject,andtoexploretheclinicalsignificanceofreal-timefluorescentquantitativePCRmethod.MainlyintroducesthenucleicacidextractionofDNAorRNA,real-timefluorescentquantitativePCRandreal-timefluorescencequantitativePCRmethodforclinicalapplicationsignificance:
hepatitisBvirusDNAbyreal-timefluorescentquantitativePCRassayapplicationinclinicaldiagnosis,real-timefluorescentPCRdetectionofhepatitisCvirusnucleicacidanditsclinicalapplication,thereal-timefluorescencequantitativePCRassayinthedetectionofMycobacteriumtuberculosisDNAinplasmaclinicalapplication,real-timefluorescencequantitativePCRdetectionofHPVvirus,theclinicalapplicationofurogenitalChlamydiatrachomatisinfectionintheclinicalapplicationofinfectiousdiseases,clinicalapplication,measuredinpancreaticcancerHIF1,VEGFandbFGFexpressionanditsclinicalsignificance,sheeppulmonaryadenomatosisvirusdetectionoflymphnodemicrometastasis,sensitiveandspecificmethod,real-timefluorescencequantitativePCRmethodappliedinclinicaldetectioninclinicalstaging,prognosisandtreatmentoptionshaveimportantsignificance.keywordkeywordreal-timefluorescencequantitativePCR;
hepatitisB;
hepatitisCvirus;
infectiousdiseases;
HPV;
MTB;
PCR法最初由Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。
此想法的提出在1983年,美国Cetus公司Mullis博士发明了PCR技术,使Khorana的设想变成实现。
1985年,美国PerkinElmerCetus公司发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PolymerasechainreactionPCR),人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。
随便人类对PCR法的研究深入1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)引入了PCR技术,使PCR技术的应用价值大大提高。
1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。
国际为表彰Mullis在PCR的发明,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
随便PCR技术的运用在医疗检测的方面推广,已经作为一标准取代细胞法的“金标准”,目前实时荧光定量PCR技术被广泛应用于实验研究、临床检测中。
与普通的PCR相比。
实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优式,RTFQPCR相比传统的PCR具有以下重要优点:
它使用荧光基团对PCR每个循环中的扩增产物进行实时监测,操作简便且具有很高的敏感性和特异性;
实现了定性到定量分析的飞跃;
DNA扩增及其分析过程均在同一封闭系统中完成,避免了样品和产物的污染,且不需要复杂的产物后续处理从而能得到可靠和可重复性的结果;
动力学范围宽,允许对样品的靶序列进行不同数量级的分析。
目前应用实时荧光定量PCR检测在临床的项目很多如:
实时荧光定量检测的含量的方法,探讨其在乙型肝炎预防、诊断、治疗及判断病情等方面的临床应用价值;
运用实时荧光PCR检测技术在丙型肝炎病原诊断及在监测干扰素一a治疗慢性丙型肝炎早期病毒学应答反应(EVR)中的临床意义;
实时荧光方法在传染性疾病检测研究中的应用;
实时荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体的临床应用;
实时荧光定量法在检测血浆结核杆菌的应用及价值;
实时荧光定量PCR检测宫颈癌患者HPV病毒负载量的研究等等。
1.1.资料与方法资料与方法1.11.1核酸核酸DDNNAA的提取的提取资料与方法资料与方法:
1.1.1DNA提取的经典方法:
即所谓的酚-氯仿提取法。
因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去,提取次序为酚、酚/氯仿(1:
1)、氯仿,这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好,缺点是较为繁琐。
1.1.2胍盐提取结合二氧化硅吸附法:
二氧化硅具有特异吸附核酸的特性,异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下,从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上,利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。
目前厦门安普利生物工程有限公司采用此固相吸附法可以在保证结果的前提下,省去许多繁琐的操作。
1.1.3TRIzol试剂提取RNA方法:
用TRIzol试剂裂解细胞,再加入氯仿,离心后可见三层,上层为透明的水相含有RNA,中间层含DNA,下层为红色的有机相,含蛋白质。
1.1.4旋转离心柱提取:
旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法,属于硅吸附方法的一种,市场上的离心柱各有特色。
1.21.2实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术资料与方法资料与方法:
1.2.1实时荧光定量PCR的基本原理:
样本核酸扩增呈指数增长在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比。
由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过检测荧光量即可测定样本核酸量。
通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
Ct值(cyclethreshold),即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,模板DNA量越多,荧光达阈值的循环数越少,即Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
在实时荧光PCR技术的发展过程中,2个重要的发现起着关键的作用:
在20世纪90年代早期,TaqDNA多聚酶的5核酸外切酶活性被发现,它能降解特异性荧光标记探针,因此使得间接检测PCR产物成为可能;
此后,荧光双标记探针的运用,使得在一个密闭的反应管中能实时监测反应全过程。
1.2.2实时荧光定量PCR类型和特点:
根据RTFQPCR所使用的荧光化学方法的不同,荧光定量PCR技术主要分为染料法、荧光探针法。
染料法中以SYBRGreenI染料的应用最广泛。
SYBRGreenI能与所有双链DNA小沟结合,在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料,能特异性地掺人DNA双链,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
探针法是在待扩增区域结合上DNA探针,在PCR过程中,具有5一3外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时,将DNA探针逐个降解,释放出荧光报告基团,这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间呈正比,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。
常用的探针法包括TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针和荧光标记引物。
探针法因增加了探针的识别步骤,特异性更高,而染料法的优点是简便易行。
1.2.3实时荧光定量PCR定量方法:
RTFQPCR的模板定量包括相对定量和绝对定量。
前者是指在一定样本中的靶序列相对于另一参照样本的量的变化;
后者指的是用已知标准曲线来推算未知样本的量。
分为三种方式:
1:
标准曲线法的绝对定量;
2:
标准曲线法的相对定量;
3:
比较Ct法的相对定量。
2.2.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR检测临床上的运用检测临床上的运用2.12.1乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量检测在临床诊断中的检测在临床诊断中的应应用用乙型肝炎病毒()是乙型肝炎的病源体,感染人体是一个连续、动态的过程,平时我们所用的法检测的免疫标志物(、),可在一定程度上反映病毒是否处于复制状态,但是不可避复制过程,敏感性更强,特异性更高,通过探讨血清的与免疫标志物的相关性,符合性和补充性,从而进一步证实的检测在乙肝早期诊断,传染性识别,病毒复制水平判断以及抗病毒治疗效果,监测中的临床运用。
2.22.2实时荧光实时荧光PCRPCR检测丙型肝炎病毒核酸及其临床检测丙型肝炎病毒核酸及其临床应应用用丙型肝炎病毒是一种RNA病毒(HCVRNA),目前可分为6个不同的基因型及亚型,如1a、2b、3c等。
基因1型呈全球性分布,占所有HCV感染的70%以上。
实时荧光PCR检测丙型肝炎病毒核酸是采用的实时荧光PCR定量检测丙肝病毒核酸是近年来新发展的PCR荧光检测技术,其与传统的Nested一PCR相比,后者以琼脂糖凝胶电泳加澳乙锭后于紫外灯下肉眼观察PCR产物,虽比较简单,但过于粗糙,且假阳性较多,亦无法量化,而实时荧光PCR检测技术则操作更简便,HCV一RNA逆转录与PCR可在同管一步扩增即能快速、特异地检测出被检标本中的病毒载量,并设有内标监控标本处理,逆转录及PCR全过程,有效地避免了假阴性,提高了实验的精确度;
灵敏度提高约2个单位。
因此,实时荧光PCR具有
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