蛋白质分离纯化与层析技术进展_精品文档资料下载.pdf

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很多蛋白质在实验室规模已生产成功,但却无法走向工业化生产而取得经济效益和社会效益1。

因此,急需发展蛋白质分离纯化技术。

1蛋白质分离纯化的特点和需要解决的问题111蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。

2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。

例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。

有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。

3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。

4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等。

112实现蛋白质产品的分离纯化应解决的问题1）设计蛋白质产品分离纯化的最佳工艺,用最少的分离步骤获得最大的产率,同时确保来稿日期6228鲍时翔,男,66年生,博士后;

主要研究方向蛋白质纯化工程,发酵工程。

华南理工大学生物工程系,邮编56:

19901119:

1041蛋白质产品的纯度。

2）发展蛋白质纯度的快速分析检测技术。

在下游的各道工序,准确、快速地对蛋白质产品进行纯度分析和活性检测,以保证产品的质量。

3）搞好上、中、下游技术的配合,便于蛋白质产品的分离纯化。

大多数蛋白质产品的分离纯化,需消耗大量的人力、物力,因此应尽可能改进上、中游技术,减少下游过程负荷。

例如,利用金黄色葡萄球菌,发酵生产A蛋白。

通常,A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,然后将A蛋白从胞壁上剪切下来,过程繁琐,难度大。

若运用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A蛋白的分离纯化就容易得多。

2层析技术在蛋白质分离纯化中的地位分离纯化蛋白质的方法很多2,对于不同的目标产物,分离纯化方法不同。

选择合适的工艺路线,取决于目标产物的理化、生物特性。

例如,目标产物和杂质的密度不一样,可采用离心技术加以分离;

目标产物和杂质在一定的溶液环境中溶解度不同,可采用沉淀技术加以分离;

目标产物和杂质在亲水性高分子两相溶液中分配不同,可采用双水相萃取技术加以分离;

若目标产物和杂质等电点不同,可采用离子交换层析和电泳技术分离。

通常,为获得高纯度目标产物,往往需要综合利用目标产物的理化特性,采用多种分离技术组合,但分离步骤多,分离时间长,则影响目标产物的得率和回收。

在众多的蛋白质分离纯化技术中,层析是一门关键的技术,它通常在分离工序的后部,决定着产品的纯度和收率。

和其它分离技术相比,层析技术具有以下特点:

1）分离效率高。

离心、沉淀、双水相萃取技术往往只能获取粗产品,而运用层析技术,可得到纯度较高的生物产品。

例如,在中空纤维膜反应器内培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,单克隆抗体存在于杂交瘤细胞培养液中。

采用沉淀分离技术只能获得粗产品,为提高单克隆抗体纯度,还必须结合离子交换层析、分子筛层析等3。

若运用亲和层析技术,以A蛋白为配基,从杂交瘤细胞培养上清液中,经一步纯化,得到的单克隆抗体纯度可达到电泳纯4;

2）和电泳分离相比,层析过程易于放大,易于自动化。

若采用电泳技术分离蛋白质,虽然产品纯度非常高,但其过程却产生大量的热,不但有损于蛋白质的生物活性,而且过程难于放大。

层析过程并不产生明显的热量,放大可采用加大柱径和高度的方法。

运用计算机进行控制,还可实现操作过程的自动化5,6;

3）层析技术适用性广。

差不多每一种蛋白质纯化过程都包括层析技术,或者是离子交换层析,或者是分子筛层析,或者是几种层析技术的组合。

针对蛋白质不同的生物特性,采用不同的层析技术,可获得纯度很高的蛋白质产品。

在蛋白质分离纯化方法中,层析技术占有重要地位。

当然层析技术的成功应用也需要和其它的分离技术相配合。

特别是前面的离心、沉淀等过程对层析效果的好坏也有很大的影响。

3层析技术进展本世纪初,俄国植物学家T,用石油醚萃取植物色素,然后注入填有碳酸钙的玻璃柱,以石油醚冲洗,得到分离的黄色、绿色区带,所以称为色谱。

色谱分离又称层析。

最初,99第12期鲍时翔等:

蛋白质分离纯化与层析技术进展swett7层析技术发展缓慢。

到50年代,气液层析的发展,给层析技术的工业应用带来了光明。

随着层析固定相的开发,层析作为一门工业技术,广泛用于各种化学物质的分析、分离。

到60年代,由于开发出适用于生物物质分离纯化的层析固定相,层析技术才被用于生物物质的分离纯化并得到迅速发展。

蛋白质层析技术进展表现在以下三方面:

新型层析方法、新型层析固定相和对层析过程进行数学模拟的深入研究。

311层析方法层析分离是基于固定相对流动相中各组份阻滞能力的大小,各种层析方法,其阻滞机理不同。

根据固定相对物料组份阻滞机理的不同,层析可分为分子筛层析、羟基磷灰石层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相作用层析、亲和层析等。

分子筛层析又称凝胶过滤层析或尺寸排阻层析,它是利用各组份分子体积大小与形状的不同将组份分开。

分子筛层析的分离精度不高,常用于分子大小相差悬殊的蛋白质的分离纯化或蛋白质溶液的脱盐。

羟基磷灰石层析基于羟基磷灰石对一些蛋白质的吸附作用进行分离。

虽然羟基磷灰石层析应用有限,但其分离成本低,在对某些蛋白质如血浆铜蓝蛋白的分离有独到之处。

离子交换层析是早期蛋白质层析方法之一,目前仍被普遍使用。

疏水作用层析、反相作用层析利用组份间疏水性的差异分离各组份。

用于疏水作用层析、反相作用层析的固定相表面都带有疏水作用基团。

不同的是,疏水作用层析固定相表面的疏水基团疏水性弱,一定盐浓度的蛋白溶液流过固定相时,蛋白质被吸附,然后以低盐水溶液作为洗脱剂进行洗脱。

而反相作用层析固定相表面的基团疏水性强,蛋白质水溶液流过固定相时,蛋白质被吸附,然后用有机溶剂洗脱。

疏水作用层析多用于大分子蛋白质的分离纯化。

反相作用层析分离蛋白质时,蛋白质容易变性失活。

一般用于小分子蛋白质、多肽和氨基酸的分析、分离。

亲和层析是60年代发展起来的一种高效、快速蛋白质分离纯化技术。

通常的层析方法都是利用蛋白质理化性质的差异来进行分离的,这种差异往往并不是很大,所以,分离精度不高。

亲和层析则利用蛋白质分子与某一分子专一可逆结合的生物特性,来选择分离目标蛋白质。

亲和层析容量大,分离效率高,且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。

随着染料配基、人工定向合成配基的应用和配基偶联技术的发展,亲和层析技术更加适用化8。

特别是由于任何蛋白质都具有抗原性,通过杂交瘤技术均可制备相应的特异性单抗,以单抗为亲和配基,去分离对应的目标蛋白质,可以实现各种天然、重组蛋白质的高效、快速分离纯化。

近年来,随着人们对蛋白质分子结构的深入研究和其它学科的发展,又出现了一些新的蛋白质层析方法,如金属螯合层析、层析聚焦等9,10。

这些层析技术在蛋白质分离纯化上都发挥着重要作用。

表1给出了一些常用的层析方法及其特征。

312层析固定相各种层析技术的成功应用,首先要有合适的层析固定相,可以说,层析固定相决定着层析技术的发展。

大多数层析固定相是官能化的载体,所以,层析固定相又直接决定于层析载体。

早期使用的各种强酸、强碱型离子交换树脂等固定相不适用于蛋白质的分离。

适用于蛋白质分离纯化的固定相必须具有高度的亲水性,并具有一定的三维空间结构和疏散度,以便于生物物质的扩散进出,通过表面作用或体积排阻实现蛋白质的分离。

到60年代,纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖凝胶等的使用,使各种蛋白质层析技术的应用得以实现。

琼脂糖由于其高度的亲水性、颗粒网孔结构的均一性和惰性,是一种很好的层析载体。

但琼脂糖凝胶易压缩,使得层析001华南理工大学学报第24卷表1常用层析方法及其特征Table1Methodsofvariouschromatographyandcharacteristics层析方法作用原理分辨率容量分子筛层析分子体积与形状低低离子交换层析离子交换中高疏水作用层析疏水作用中中反相作用层析疏水作用中中亲和层析:

生物专一亲和层析生物活性高高免疫亲和层析抗原与抗体作用高高染料亲和层析蛋白质与染料分子吸附中高金属螫合亲和层析蛋白质与金属离子络合中高层析聚焦等电点高中柱的放大受到限制。

交联琼脂糖的刚性、对pH值和温度的稳定性比琼脂糖大大提高。

到70年代末,高效液相层析的开发成功,可以说是层析技术上的一次革命11。

高效液相层析大多以硅胶、合成聚合物为层析固定相载体。

和常规层析不同的是,高效液相层析固定相颗粒刚性大,粒径小,一般在510m,目标产物在颗粒内传质快,层析操作时间短,分辨率高。

通过对硅胶、合成聚合物表面进行修饰,可以实现分子筛、离子交换、疏水作用、反相作用、亲和等高效液相层析。

目前,高效液相层析已被广泛用于各种生物物质的分析和制备。

由于高效液相层析使用小颗粒固定相,所以操作压降很高,在设备上高效液相层析需要高压泵,层析柱、阀门、管道必须由不锈钢制造,设备价格昂贵。

为了避免高压操作带来的问题,人们又开发出各种新型的制备层析介质,如灌注层析介质、膜介质等1214。

1987年美国PerseptiveBiosystems公司首推灌注层析介质。

灌注层析的特点是含有双孔结构,即除了常规层析介质的大量微孔外,还含有纵横交错贯穿介质的“大孔”。

快速蛋白质液相层析系统就是采用这种介质为固定相,其操作压降介于常规和高效液相层析之间。

膜层析则是以膜为载体,对膜的内外表面进行修饰,接上官能团来分离纯化蛋白质。

由于膜具有良好的通透性和耐压性,使得层析可以高效、快速进行。

灌注层析介质与膜介质的开发,是层析技术的新突破。

313层析过程的数学模拟随着新型层析方法、新型层析固定相的开发,人们对蛋白质层析过程也在进行深入研究。

在分析层析机理和过程的基础上,建立描述层析过程的数学模型,不但可以阐明层析作用机理,而且可以优化操作,并为层析过程的放大、设计提供理论依据。

按组份在流动相和固定相间的分配,层析可以分为线性层析和非线性层析。

线性层析是指组份在流动相和固定相间的分配呈线性关系;

非线性层析是指组份在流动相与固定相间分配呈非线性关系。

按操作规模和目的来分,层析可分为分析层析和制备层析。

分析层析是为了获得样品组成信息,进样浓度低,进样量少;

制备层析是为了分离制备产品,为了提高设备的生产能力,总是尽可能提高进料浓度和进料量。

对于制备层析,目标组份在流动相和固定相间分配大都呈非线性关系,属非线性层析。

描述层析过程的理论分为两类塔板理论和速率理论5。

塔板理论将层析柱视为系列塔101第12期鲍时翔等:

蛋白质分离纯化与层析技术进展:

1板构成,并假设塔板上