PKH26说明书中文.docx
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PKH26说明书中文.docx
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PKH26说明书中文
PKH26说明书(中文)
D
试剂组成
PKH26染料*(P9691)
稀释液C(G8278)
MINI26
1×0.1mL
1×10mL
MIDI26
2×0.1mL
6×10mL
PKH26GL
1×0.5mL
6×10mL
*1×10-3M(溶于乙醇)
MINI26试剂盒推荐用于小的或初步试验研究,PKH26GL用于体内实验研究
所需设备和试剂(试剂盒未提供)
·充分分散的单个悬浮细胞
·含血清的组织培养基(完全培养基)
·无Ca2+,Mg2+和血清的培养基或者缓冲盐(如Dulbecco’sPBS或Hank’sBSS)
·血清,白蛋白或其它组织兼容性蛋白
·离心管(4-15mL)
·温控离心机(1,000×g)
·荧光分析设备(荧光读板机,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)
·层流罩
·血球计数板或细胞计数器
·载玻片和盖玻片
注意事项和免责说明
该产品仅用于科研,不用于制药、家庭或其它用途。
请遵照安全数据清单中关于有害及安全操作规范操作。
储存/稳定性
PKH26乙醇溶液(货号P9691)可室温或冷藏保存。
减少蒸发以防止染料浓度升高。
保证染料乙醇溶液瓶盖盖紧。
该染料避光保存,使用前观察是否有结晶。
如出现结晶,37℃热水浴加热,然后超声或震荡直至溶解。
稀释液C可室温或冷藏保存。
如果冷藏保存,使用前复温至室温(过程,步骤A5和A6)。
稀释液C为无菌溶液,不含任何防腐剂和抗生素,其需保持无菌。
不要将染料储存于稀释液C中。
溶于稀释液C的工作液需现配现用,且配好后需立即使用。
操作过程
A.一般细胞膜标记
亲脂性染料结合到细胞膜上完成标记。
染色强度是染料浓度和细胞浓度的函数,与渗透性无关。
因此,保证染料添加量不过量非常关键。
过标记的细胞将会导致细胞膜完整性缺失和reducedcellrecovery。
下列过程可用于体内体外细胞的标记,包括干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经细胞或者任何其他细胞。
体内细胞的标记过程需一定的改进,如血小板的染色,或者选择性标记吞噬细胞。
Generalcellmembranelabelingshouldbeperformedpriortomonoclonalantibodystaining.Themembranedyeswillremainstableduringthemonoclonalstainingat4℃;however,cappingofthemonoclonalantibodiesishighlyprobableifthegeneralcellmembranelabelingiscarriedoutatambienttemperaturesubsequenttoantibodylabeling.
下述染色过程中细胞浓度和染料浓度代表操作的起始浓度。
该浓度被证明适用于多种细胞。
使用者需通过评估染色后细胞活率(如,PI染色)、荧光强度、染色均匀度及是否对所研究细胞功能有影响等,根据实验目的,确定最优的染料浓度和细胞浓度。
注意1:
PKH26染色过程中,不能存在叠氮化物或代谢毒性物。
注意2:
虽然贴壁细胞也可以染色,但单个悬浮细胞染色均一性更佳。
因此用蛋白酶(trypsin/EDTA)将贴壁细胞消化成单个悬浮细胞后再染色效果更佳。
下列过程最终体积为2mL,PKH26浓度为2×10-6M,细胞浓度为1×107cells/mL。
以下过程均在室温下进行(20-25℃)
1.将2×107个细胞于离心管中,用不含血清
培养基洗一遍。
注意:
血清蛋白和脂质会与染料结合,降低与细胞膜结合的染料浓度。
最好在用稀释液C重悬细胞染色前(第四步)用无血清培养基或缓冲液洗细胞一次(第一步)。
2.400×g离心5分钟。
注意:
PKH26染料不能直接加到离心沉淀中,这样会造成细胞染色不均一和细胞活力降低。
3.离心后,小心吸弃上层清液,剩余上层细
胞液体积不超过25μL。
注意:
为得到可重复的实验结果,在用稀释液C重悬时,减少残留培养基或缓冲液体积非常重要。
见参考文献9的注意28。
4.加入1mL稀释液C(CatalogNumber
G8278),用移液管轻轻吹打混匀,制备
2×细胞悬液。
不要用振荡器震荡,不要让
细胞在稀释液C中保存太长时间。
注意:
生理盐(physiologicsalts)的存在会使得染料结团并大幅降低染色效率。
因此,需确保染色时细胞悬浮于稀释液C中,不含培养基或缓冲盐。
5.临染色之前,将4μLPKH26乙醇溶液加
入1mL稀释液C中,充分混匀,配制的
2×染色液(4×10-6M)。
注意1:
为减少乙醇对细胞活率的影响,步骤5加入的染料使得步骤6中乙醇最终浓度不能超过1-2%。
注意2:
如果所需染料最终浓度<2×10-6M,需用100%乙醇将PKH26稀释于另一单独的容器中,以确保实验结果的可重复性。
6.快速将1mL2×细胞悬液(步骤4)加入
1mL2×染色液(步骤5)中,立即用移液
管混匀。
最终细胞浓度为1×107/mL,
PKH26浓度为2×10-6M。
注意:
由于染色瞬间完成,快速将细胞与染料混匀对得到明亮、均匀和可重复的标记结果非常重要。
下列措施有助于得到较优的结果:
a.不要将PKH26染料直接加入含2×细胞
的稀释液C中。
b.将2×细胞悬液(步骤4)与2×染色液
(步骤5)等体积混合。
c.调整2×细胞和2×染料的浓度避免染色
体积太小(<100μL)或太大(>5mL)。
d.用电动移液器快速将细胞和染料混匀。
血清移液管混匀速度太慢而使得染色不
均匀。
Racking和旋涡震荡混匀同样混匀
较慢,染色均一性较差。
e.分配体积尽量准确,以保证样品与样品
之间,实验与实验之间的可重复性。
7.混匀后的染色的细胞孵育1-5min。
由于
染色速度较快,延长孵育时间对实验没有
帮助。
注意:
让细胞在染色液中停留尽量短的时间,同时保证得到理想的染色强度。
因为稀释液C缺少生理性盐,过长时间的暴露在稀释液C中会造成某些细胞活力降低。
如果不能确定其影响程度,可增加仅作稀释的对照组和只用乙醇而不用染料染色的对照组。
8.加入等体积的血清(2mL)或其它合适的
蛋白溶液(如1%BSA)终止反应,孵育
1min以结合多余的染料。
注意1:
血清(或等效的蛋白浓度)为最优的终止
液。
如果用完全培养基替代,添加体积为10mL。
注意2:
不要通过加稀释液C或离心来终止反应。
注意3:
不要用无血清培养基或缓冲盐,他们会使染料产生聚集。
染料聚集使清洗过程中无法洗净,使得分析过程中仍存在未标记的细胞。
9.将细胞在20-25℃条件下400×g离心10
min,小心吸弃上清。
用10mL完全培养
基重悬,将重悬液转移至另一新的无菌离
心管中,20-25℃条件下400×g离心5min。
用10mL完全培养基再清洗两遍以除去没
结合的染料。
注意1:
将重悬液转移至新离心管中,减少了离心管壁残留的染料对洗涤效率的影响;
注意2:
不要用稀释液C清洗。
10.最后一步清洗后,用10mL完全培养基
重悬细胞评估细胞回收率,细胞活率和荧
光强度(图2。
离心重悬细胞至所需活细
胞浓度。
注意1:
染色后的细胞可以用中性甲醛固定,避光条件下,荧光强度至少3周内保持稳定。
注意2:
染色荧光强度一般为背景的100-1000倍。
虽然染色的CV值与细胞种类有关,但荧光分布应该尽量均匀对称。
图2.PKH26染色优化
MC-38TIL细胞用上述指定PKH26浓度染色,最终细胞浓度为1×107/ml。
活力(▲)由FITC染色测定,平均荧光强度(●)用流式细胞仪检测。
用20μMPKH26标记后,抗肿瘤TIL特异性和效能没有改变。
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