不同样本处理方法对显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因的影响Word格式文档下载.docx
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选择一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法,用于显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药基因。
方法:
选择3份含结核分枝杆菌分别为4.325×
103、6.857×
104、5.356×
105Copies/ml的痰液,分别用Chelex100树脂法、煮沸法、蛋白酶K消化异丙醇沉淀法、蛋白酶K消化酚/氯仿抽提法、碱裂解法、异硫氰酸胍裂解法、盐酸胍裂解法、离心柱法抽提结核分枝杆菌DNA作多重聚合酶链反应,显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因。
结果:
离心柱法检测结果阳性,其余方法检测结果均为阴性,离心柱法检测灵敏度为2.743×
103Copies/ml。
结论:
离心柱法是一种较为理想的从痰标本中直接抽提结核分枝杆菌DNA的方法,可用于显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因。
[关键词]痰标本;
EffectofVariedSampleTreatmentProceduresonDetectionoftheResistanceGenesofRifampinandIsoniazidinMycobacteriumTuberculosisDNAbyUsingColorationGenesChips
Abstract:
ObjectiveTochooseamoreidealmethodtodirectlyextractMycobacteriumtuberculosisDNAfromsputumsampletodetecttheresistancegenesofrifampin(RFP)andisoniazid(INH)inMycobacteriumtuberculosisbyusingColorationgenechips.MethodsChoosethreesputumsampleswhoseMycobacteriumtuberculosisrespectivelywere4.325×
103,6.857×
104and5.356×
105Copies/ml.Respectivelyusechelex100resinate,boilingextraction,proteinaseKdigest/isopropanolprecipitation,proteinaseKdigest/phenol/chloroformextraction,alkalinelysis,guanidinethiocyanatelysis,guanidinehydrochloridelysis,spincolumnmethodtoextractMycobacteriumtuberculosisDNAformultiplepolymerasechaineraction.ResultsTheresultofspincolumnmethodwaspositive.Otherswerenegative.Thesensitivityofspincolumnmethodwas2.743×
103Copies/ml.ConclusionThespincolumnisamoreidealmethodtoextractMycobacteriumtuberculosisDNAfromsputumsample,whichcanbeusedtodetectresistancegenesofRFPandINHinMycobacteriumtuberculosisbyusingcolorationgenechips.
Keywords:
Sputumsample;
MycobacteriumtuberculosisDNA;
Extract;
Coloration;
Resistancegene;
Genechip
DNA芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法,是物理学、微电子学与生命科学等学科的交叉结合,具有高灵敏、高通量等优点,通过一次测定可获得大量信息。
芯片法检测结核分枝杆菌的耐药基因,是近年来研究较多的一个课题[1~7],由于结核分枝杆菌全基因扩增或多重PCR的困难性,目前研究结核分枝杆菌耐药基因多采用结核分枝杆菌临床分离株作DNA抽提[1,5,8,9],这给临床早期诊断,早期治疗带来了严重问题。
我们选用了8种DNA抽提方法直接抽提痰液中结核分枝杆菌DNA,用于显色法芯片检测结核分枝杆菌利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药基因检测,现报告如下。
1 材料和方法
1.1 痰液标本
1.1.1 含结核分枝杆菌痰液 3份含结核分枝杆菌痰液来自盐城市第二人民医院住院患者,经培养证实为结核分枝杆菌阳性,并经荧光定量PCR检测其含量分别为4.325×
105Copies/ml。
1.1.2 不含结核分枝杆菌痰液 来自盐城市第一人民医院呼吸科住院患者。
1.2 痰液液化与浓集 取痰液加入2.5倍4%NaOH37℃30min,取液化后痰液1ml13000rpm10min,弃上清,沉淀用1ml生理盐水悬浮,同上离心条件洗涤2次,沉淀物备用。
1.3 结核分枝杆菌DNA抽提
1.3.1 Chelex100树脂法[1] 痰沉淀物加30μl提取液(15%Chelex100)37℃30min,再100℃10min后,13000rpm离心10min,上清液备用。
1.3.2 煮沸法[10] 痰沉淀物悬浮在250μlSTET溶液中加入25μl新鲜配制的10mg/ml溶菌酶溶液混匀,于100℃10min,1300rpm离心10min上清液备用。
1.3.3 蛋白酶K消化异丙醇沉淀法[11] 在痰沉淀物中加溶菌酶(25mg/ml)50μl,37℃90min,加蛋白酶K(5mg/ml)40μl60℃2h,加1/10体积NaAc(3mol/l)混匀,加2倍体积异丙醇混匀,1300rpm离心10min,用70%乙醇漂洗沉淀物2次,开盖室温15min使乙醇挥发,加20μlTE溶解DNA备用。
1.3.4 蛋白酶K消化酚/氯仿抽提法[12] 取痰沉淀物加溶菌酶、蛋白酶K同蛋白酶K消化异丙醇沉淀法,处理后的溶液用酚/氯仿抽提,异丙醇沉淀DNA,乙醇漂洗,TE溶解备用。
1.3.5 碱裂解法[10] 在痰沉淀物中加2倍体积0.2mol/LNaOH(含1%SDS)混合5min,用冰醋酸钾盐缓冲液使呈中性,1300rpm离心10min上清液备用。
1.3.6 异硫氰酸胍裂解法[10] 用200μl异硫氰酸胍液悬浮痰沉淀物混匀,室温放置5min用2倍体积异丙醇混匀,1300rpm离心10min,用70%乙醇漂洗沉淀物2次,开盖室温15min使乙醇挥发,加20μlTE溶解DNA备用。
1.3.7 盐酸胍裂解法[10] 在痰沉淀物中加7.5倍体积盐酸胍裂解液,室温1h,用2倍体积异丙醇混匀,1300rpm离心10min,用70%乙醇漂洗沉淀物2次,开盖室温15min使乙醇挥发,加20μlTE溶解DNA备用。
1.3.8 离心柱法 采用天为公司细菌基因组DNA提取试剂盒,具体操作为痰沉淀物加200μl缓冲液Ⅰ、加蛋白酶K(20mg/ml)溶液20μl混匀,加220μl缓冲液Ⅱ,70℃10min,加220μl无水乙醇混匀后移入吸附柱中,12000rpm30s弃废液,加入500μl含无水乙醇去蛋白液12000rpm30s弃废液,再用700μl含无水乙醇缓冲液漂洗2次,12000rpm30s弃废液,加50μlTE室温5min,2000rpm30s离心,所得溶液备用。
1.4 PCR 参照郭乃洲等[1]报道的显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因的4对引物,分别扩增rpoB、katG、inhA和ahpC4个基因的部分片段,目的片段含结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因8个位点的25种单核苷酸。
1.5 芯片检测 将PCR产物98℃热变性5min,迅速至冰浴5min,取变性后扩增产物1.5μl与15μl杂交液混合,充分混匀,滴加于芯片点样区,盖上盖玻片,置60℃预热的杂交盒中杂交30min;
用洗液Ⅰ(150mmol/LNaCl,150mmol/L柠檬酸钠,0.1%SDS)60℃振荡洗涤10min,洗液Ⅱ(150mmol/L马来酸,150mmol/LNaCl,0.3%Tween20,pH7.5)漂洗1min,吹干,加上1∶25稀释碱性磷酸酶标记地高辛抗体,盖上盖玻片,37℃3min;
再用洗液Ⅰ荡洗10min,洗液Ⅱ漂洗30s后加50μl平衡液平衡1min,取一块1cm2×
1cm2尼龙膜,浸泡显色液(BCIP/NBTSolution)后,一次性盖于芯片表面(不可移动),迅速盖上盖玻片,避光37℃30min~40min,取下尼龙膜,用去离子水漂洗后,高温烤干,用光学扫描仪记录或用放大镜肉眼观察尼龙膜结果。
1.6 结果判断 参照芯片示意图(见图1),阴性质控Ⅰ、Ⅱ无斑点出现,阳性质控Ⅰ有斑点出现,提示试验有效;
阳性质控Ⅰ和Ⅱ均出现斑点,提示结核分枝杆菌DNA阳性;
若阳性质控Ⅱ无斑点出现,提示结核分枝杆菌DNA阴性;
若rpoB511、513、516、526、531为突变型,提示结核分枝杆菌耐RFP;
katG315、inhA启动子、ahpC启动子为突变型,提示结核分枝杆菌耐INH。
图1 芯片示意图(略)
A19阳性质控Ⅰ,B19:
阳性质控Ⅱ;
E1:
阴性质控Ⅰ,E2:
阴性质控Ⅱ;
C1:
rpoB511野生型,D1:
rpoB511突变型;
C2:
rpoB513野生型,D2:
rpoB513突变型;
C3:
rpoB516野生型,D3、E3:
rpoB516突变型;
C4:
rpoB526野生型,D4、E4、C5、D5、E5:
rpoB526突变型;
C6:
rpoB531野生型,D6、E6:
rpoB531突变型;
C7:
katG315野生型,D7、E7:
katG315突变型;
C8:
inhA野生型,D8:
inhA突变型;
C9:
ahpC野生型,E8、D9、E9:
ahpC突变型。
2 结果
2.1 8种不同DNA抽提标本对结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因结果 3份含结核分枝杆菌痰液分别用8种DNA抽提方法进行DNA抽提,再用显色法芯片检测结核分枝杆菌RFP和INH耐药基因,结果只有离心柱法能在芯片的各区域均出现结果(见图2,图3,图4)。
另3份不含结核分枝杆菌痰液结果均为阴性(见图5)。
图2 阳性标本(略)
图3 阳性标本(略)
图4 阳性标本(略)
图5 阴性标本(略)
2.2 DNA片段 离心柱法抽提的痰液结核分枝杆菌DNA经4对引物进行多重PCR后,扩增出4条DNA片段,其大小分别为165、181、245、315bp,2.5%琼脂糖电泳结果见图6
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