细胞因子检测Word下载.docx
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体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。
本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。
1、取6~10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。
2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5%小牛血清的Hanks液(5%NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次。
3、1500r/min离心8min,洗细胞2次。
4、将腹腔细胞用含10%小牛血清的RPMI-1640液(10%NBS-RPMI-1640)配成2×
106/ml,加到24孔平底培养板,1ml/孔,置5%CO2,37℃温箱孵育2h。
5、每孔用5%NBS-HBSS洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层。
6、将LPS(10μg/ml)加入巨噬细胞单层,每孔1ml,培养4h;
加入10%NBS-16401ml继续培养至48h,收集上清液,置-20℃冰箱保存,待测IL-1活性及含量。
(二)L929细胞增殖MTT比色法
MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-(4.5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下,被还原成兰黑色的MTT-甲,形成MTT-甲的量与细胞增殖程度呈正相关。
故通过测定细胞形成MTT-甲量,可间接定量分析细胞的增殖情况,具体步骤如下:
1、将生长成单层的L929细胞用0.25%胰酶消化2~3min。
除去消化液后,用10%FCS的RPMI-1640将L929细胞配成1×
105/ml,加入96孔细胞培养板中,每孔100μl。
2、取100μl不同稀释度的IL-1标准品和待测品,分别加入各孔中,每孔设3个复孔,置37℃,5%CO2温箱孵育56h。
3、用PBS溶解MTT为5mg/ml,用0.22μm膜滤器除菌及杂质。
4、上述培养体系取出后,每孔加入10μlMTT(5mg/ml),37℃继续培养4h。
5、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSO100μl/孔,充分混匀以溶解底物。
酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTT-甲转化物的测定。
6、将微量测定板置室温数分钟,保证转变的底物结晶被溶解。
7、用酶标光度计以检测波长为570nm,参考波长为630nm分别测量OD值。
测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成。
OD570nm-OD630nm,再减去培养液对照的OD值。
8、用IL-1标准品各稀释度IL-1含量(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归,按上述概率单位分析法计算待测样品IL-2的活性单位(u/ml)。
(三)注意事项
1、IL-1诱生剂的浓度,培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,应进行预试验以确定最佳实验条件。
2、培养器皿和研磨条件:
24孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。
玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。
大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。
研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网。
二、TNF的检测(免疫学测定法,双抗体ELISA夹心法)
(一)原理选用两种针对rHuTNF-α分子不同表位的单克隆抗体,一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF-α,则形成抗体-TNF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色,亦可根据标准品OD值绘制标准曲线,从标准曲线上查出待检标本中TNF-α的含量。
(二)材料和试剂
1、包被抗体:
使用时用包被缓冲液作适当稀释。
2、酶标抗体:
使用时用稀释液作适当稀释。
3、标准品:
rHuTNF-α(10ng/ml),使用时用稀释液作倍比稀释。
4、阴性对照液(未免疫鼠Ig)。
5、ABTS底物:
2,2'
-Azino-bis-(3-ehtylbenzthiozoline6-sulfonicacid),2,2'
-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸)。
6、96孔ELISA板。
7、0.15mol/L,pH7.4PBS:
配其它液体用。
8、包被缓冲液:
0.05mol/L,pH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
9、洗涤液:
0.05%Tween20-PBS。
10、稀释液:
4%PEG-洗涤液(用于稀释标准品和酶标抗体)。
11、底物缓冲液:
0.1mol/L,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
12、3%H2O2。
13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释。
14、ELISA读数仪等。
(三)操作步骤
1、包被将稀释好的包被抗体加入ELISA板,100μl/孔,4%放置24h或48h。
2、加待检标本洗涤液冲洗ELISA板3次,加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,100μl/孔,37%,1h.标准品稀释方法:
取标准品150μl(10ng/ml)倍比稀释7个浓度:
5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml和78pg/ml。
3、加酶标抗体:
洗板3次,加入稀释好的酶标抗体,100μl/孔,37℃,1h。
4、显色:
洗板3次,加入配好的ABTS显色液,100μl/孔,室温或37℃显色15~30min。
5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线。
6、从标准曲线查得待测样品中的TNF-α含量。
四、注意事项
1、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清。
2、标本在2~8℃可储存3天,超过3天应放入-20℃或-70℃,避免反复冻融.
3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。
4、叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。
5、底物显色液必须临用时配制,双氧水应放置在2~8℃,保存6个月以内。
附:
试剂配制
1.0.15mol/L,pH7.4PBS
KH2PO40.2g
Na2HPO4·
12H2O2.9g
NaCl8.0g
KCl0.2g
双蒸水加至100ml
2.包被缓冲液
Na2CO31.59g
NaHCO32.93g
双蒸水加至1000ml
3.洗涤液
PBS1000ml
Tween200.5ml
4.稀释液
洗涤液100ml
鸡蛋清0.6ml
PEG(聚乙二醇,MW6000)2.0g
NaCl2.9g
5.底物缓冲液
12H2O1.79g
拧檬酸1.29g
6.ABS显色液
ABTS5mg
底物缓冲液10ml
3%H2O220μl
三、IL-2的检测(基因的检测)
细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检测,常用的方法有Southern印迹,斑点印迹,PCR,原位杂交及原位PCR等,Northern印迹及RT-PCR。
本文介绍IL-2mRNA的测定(斑点杂交法)。
将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上,可用手工操作点样,也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。
本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。
由于其操作比Northern印迹简单、迅速,所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测,故很适合于临床应用。
亦可用于DNA的检测。
但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。
(一)主要试剂
1.RNA提取试剂:
TRIZOL试剂(Gibcol,No.15596-026),DEPC水(Fluka,No.980210)
2.质粒提取试剂盒:
(Promega:
WizardMiniprepsDNA,No.117)
3.DNA片段提取试剂盒:
(LaJolla)
4.地高辛标记和检测试剂盒:
(BoerhingerMannheim,No.1093657)
5.IL-2DNA探针
6.其他试剂
(1)STE溶液0.1mol/LNaCl
10mmol/LTris.Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
(2)溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖
25mmol/LTris.Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
可配100ml,高压灭菌15min,贮存于4℃
(3)溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)
1%SDS(配20%贮存液)
盖紧瓶盖,颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物.于室温放置5~10min
(4)溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L
(5)含相应抗生素的LB培养基
(6)氯霉素(0.25g/2ml)--->
终浓度170μg/ml
(7)溶菌酶(10mg/ml,溶于10mmol/LTris.ClpH8.0)1ml
(8)无水乙醇(部分-20℃预冷).异丙醇.75%乙醇(部分4℃预冷)
(9)TE缓冲液(pH8.0)
(10)5mol/LLiCl1.5ml
(11)RNA酶,RPMI-1640,胎牛血清(FCS),ConA(刀豆蛋白A)等
(12)500μl含13%(W/V)聚乙二醇(PEG800)的1.6mol/LNaCl
(13)3mol/LNaAc、饱和酚、氯仿:
异戊醇(24:
1)
(二)主要仪器
CO2培养箱:
美国FormaScientific产品;
无菌操作台:
苏州净化设备公司产品;
图象处理分析仪:
同济医大太阳公司产品;
低温高速离心机:
上海离心机械研究所.
(三)IL-2质粒DNA探针的大量制备
1、含IL-
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- 细胞因子 检测