骨髓间充质干细胞的转染Word下载.docx
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称取1.1g五水CaCL2用双蒸水溶解,定容到100ml.高压灭菌20min.
二,实验步骤:
1,从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单个菌落,接种到3-5mlLB液体培养基中,37℃震荡培养12h左右,直至对数生长期,然后将该菌液以1:
100(1:
50)接种到100mlLB液体培养基中,37℃震荡培养2-3h至OD600nm=0.5
2,培养液在冰上冷却10min,转入离心管中,4℃下,4000r/min离心10min.
3,弃去上清液,用预冷的0.1mol/lCaCL2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30min.
4,4℃下,4000r/min离心10min.
5,弃去上清液,加入300μl预冷的0.1mol/lCaCL2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即制成感受态细胞悬液。
6,以上制备好的细胞悬液可在冰上放置,24h内用于转化实验,或添加冷冻保护剂(15-20%)后超低温-70℃冷冻贮存。
第二,将带有目的基因的载体质粒转化到感受态大肠杆菌中。
1,取200μl感受态细胞悬液(若是冷冻保存液,冰浴中使其解冻,解冻后立即进行下面操作)加入载体质粒溶液(含量不超过50ng,体积不超过2μl).
2,将含有混合液的离心管轻轻摇匀,冰上放置30min后,42℃水浴中热冲击2min,然后迅速置于冰上冷却3-5min.
3,向各管中加入100μlLB液体培养基,使总体积约为0.2ml,即制备成转化反应原液,混匀后37℃温浴15min以上,震荡培养。
此时细菌回复正常生长状态,并使转化体产生抗药性。
第三,质粒菌落的准备
1,LB培养基的配制:
称取胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g.加入适量去离子水摇动容器至容器溶解,然后用5M(mol/l)氢氧化钠调节ph到7.0,然后用去离子水定容到1L,待上述溶液完全溶解后,向另一广口瓶中加入琼脂粉,每100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉。
进行高压灭菌后,将融化的LB固体培养基在55℃水浴中,待培养基温度将至55℃即授课触摸,加入抗生素,每100mlLB培养基中加入1ml100mg/ml的卡那霉素(1g/1000ml),充分摇匀。
2,LB培养板制作:
将加入抗生素的LB培养基充分摇匀后倒入90x25mm2皿中10-20mlLB,倒板后打开盖子半盖状态,在紫外灯下10-15min.最后封口,4℃保存。
3,划板接种菌:
用接种环取新鲜培养的菌落或甘油菌液,划板接种到卡那霉素(千分之一)的LB平板上,37℃温箱孵育16-18h(一般12h开始生长菌落,时间以菌落生长状态判断。
),将平板应该反放,注意不可让菌落长太大。
4,摇菌:
(1)首先将卡那霉素2ml,解冻,然后加于200ml高压灭菌后的LB液体培养基中,摇匀,然后用5ml移液枪分装两个10ml离心管,每管5ml含卡那霉素的LB培养基。
然后立即对LB液体培养基的容量瓶封口,并酒精擦拭火焰消毒。
在使用5ml移液器过程中,枪头不可碰到容量瓶或离心管壁。
(2)其次,用10微升或0.5-1微升的抢吸取培养板上的单个菌落,然后将枪头在10ml离心管中晃动数次,将枪头打入10ml离心管中。
(3)最后,对10ml离心管封口,用记号笔记下操作时间,操作质粒菌的名称,顺序。
(如:
2011,8,17a/bs3)
(4)将接种取完的菌板封闭放于4℃,将含有卡那霉素的LB培养基放于4℃,将10ml离心管管口封闭好,用报纸包扎放于塑料泡沫中,放入摇床,37摄氏度,200r,摇16-18h(目的是使细菌快速生长,并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
)
5,储备甘油菌:
制备10-15%甘油菌液,将高压灭菌好的甘油放于4℃保存,然后将摇过的菌取出,将甘油与菌液一同放入无菌操作台中,在灭菌条件下,用剪刀剪1ml枪头一个小斜口,然后吸取400微升甘油放于3ml菌液中,然后进行涡旋震荡,待甘油菌液混匀后,将甘油菌液封口,记下标记放于-20℃保存。
注意事项:
1,卡那霉素使用时,首先应分装到ep管中以100mg/ml,每管3ml浓度放入5ml管中,-20℃保存。
第四,质粒DNA分子的大量提取
1,准备材料:
已经制备好的600ml菌液,TIANGEN(endofreeplasmidkit,K9428无内毒素质粒大提取试剂盒),20个50ml离心管,
5ml枪头,200微升枪,枪头(用于吸取RnaseRNA),计时器,吸水纸,五水酒精,异丙醇,废液钢。
2,操作步骤:
(1)取过夜培养的菌液加入50ml离心管中,配平(tem;
21℃,prog:
0,speed:
8000rpm),time:
3min。
收集菌液尽量吸除上清,由于菌液较多可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌液量以能够充分裂解为佳,菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。
(2)尽量吸除上清,为了确保上清液全部吸除,可以用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
(3)向溶液P1中,用200微升的枪吸取RnaseA加入其中,放置到圆周振荡器或移液枪吹打,混匀。
(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入7ml溶液P1(已经加入RnaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀(使用5ml枪时,可以调3.5ml,即加两次即可,以节约中间调枪时间),一定要彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解效果,从而引起提取量和纯度低。
(5)向离心管中加入7ml溶液P2,立即温和的上下翻转6-8次,轻轻混匀,室温放置5min,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA,此时菌液变的清亮粘稠,若未变清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,以后应减少菌液量。
(6)向离心管中加入7ml溶液P4,立即温和上下翻转6-8次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀,然后室温放置10min左右,800rpm,离心5-10min,然后将溶液倒入过滤器CS中,在倒入过程中过滤口下面应放置50ml离心管,慢慢推动推柄过滤,然后将滤液收集到自带的干净50ml离心管中,如果菌体过多(多于100ml),建议延长离心时间20-30min.
(7)柱平衡处理,在(6)离心过程中,向吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml离心管中)加入25ml的平衡液BL,8000rpm,(8228g)离心2min,倒掉离心管中废液,将吸附柱重新放回收集管中(对于平衡处理过的柱子最好立即使用)
(8)在(6)的滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多易引起RNA污染),上下颠倒混匀后转移到平衡后的含有50ml收集管的吸附柱CP5中。
(吸附柱CP5的最大容积是15ml,可以分2次过柱,称量调平,室温8000rpm,8228g),离心2Min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
注意:
在进行分2次过柱,每次均按以上条件进行。
(9)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(使用前按照说明加入五水乙醇)8000rpm(8228g)离心2min,弃掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
(10)重复步骤(9)
(11)向吸附柱中加入3ml五水乙醇,目的除去杂质,室温8000rpm(8228g)离心2min,倒掉废液。
(12)将吸附柱CP5重新放回收集管中8000rpm(8228g)离心5min,目的是将吸附柱中残余漂洗液去除。
漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切,PCR等),为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱CP5开盖,置于室温放置数分钟,从而彻底晾干吸附柱材料中残留的漂洗液。
(13)将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB,室温放置5min,然后室温8000rpm(8228g)离心2分钟,将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管中,-20摄氏度保存。
洗脱液用量大多少主要依据拷贝数以实验所需要的浓度来确定,洗脱缓冲液体积不少于1ml,体积过小会影响回收效率。
第五,大量质粒DNA的产物纯化
实验材料:
(1)TIANGEN大量DNA产物纯化试剂盒(规格50次)
(2)酶切反应体系:
灭菌蒸馏水55μl;
x20管即1100μl
buffer(10x)10μl;
x20管即200μl
质粒30μl,x20管即600μl
酶(15μl/管)3-5μl,x20管即100μl
总体积2000μl
1μg质粒需要至少5IU酶进行消化(1μgλDNA=5iu酶),质粒浓度0.3μg/μl(30μl即9μg),30μl质粒即需要至少5IU酶,TAKARA的酶是1μl=10iu(150iu/瓶),酶切时酶的量为十倍量使用。
但是酶的用量不应大于反应体系的十分之一。
(3)冰浴盒,1ml枪头(枪),200μl枪(枪头),5ml离心管,1.5ml离心管(20个),0.5ml离心管20个,20μl枪(枪头),废液钢
(4)DNA线性化回收体系:
漂洗液PW(操作前先往15mlPW中加入60ml无水乙醇)
平衡液BL
结合液BL
洗脱缓冲液EB
吸附柱CB3
收集管(2ml)
调节水浴锅为37℃。
实验步骤:
1,酶切体系的配制:
将20管的酶切体系放于5ml离心管中,在冰浴上进行操作,吹打混匀,分装到20个管(100μl/管),短暂离心2-3s,取出置入到37℃水浴中,放置2h.
2,酶切DNA线性化处理
(1)柱的平衡:
向吸附柱CB3中加入500μl平衡液BL,12000rpm(13400g),1min,倒掉收集管中废液,将吸附柱重新放回收集管中(当天使用)
(2)向每管酶切反应体液(100μl)中,加入5倍体积(500μl)的结合液PB,充分混匀。
(3)将
(2)中混匀溶液加入吸附柱中(20个),(吸附柱CB3的容积为800μl),室温放置2min,12000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
(4)向吸附柱CB3中加入600μl已事先加有五水乙醇的漂洗液PW,然后室温静置2min,12000rpm30-60s,倒掉收集管中废液,将吸附柱CB3放入收集管中。
(5)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12000rpm,离心30-60s,倒掉收集管中的废液。
(6)将离心吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm(1340g)离心2min,尽量去除漂洗液,将吸附柱放入室温晾干。
(7)取出吸附柱CB3放入一个干净的离心管1.5ml中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB,室温放置2min,1200rpm,收集DNA液(加入洗脱液不少于50μl).
(8)为了提高DNA回收量,可将离心得到的溶液重新加到离心吸附柱中,重复步骤。
3,DNA浓度及纯度检测:
OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA或40μg/ml单链DNA.
回收5-6μl放入ep管中,用于检测浓度防止反复冻融。
(1)首先用超纯水冲洗比色
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