大学生物化学简答题总结蛋白质免费Word文档格式.docx
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2、根据分子组成可将蛋白质分为两类。
(1)简单蛋白质:
仅由肽链组成,不包含其它辅助成分的蛋白质称简单蛋白质(simpleprotein),按照溶解度的差别,可将简单蛋白质分为7类,清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白
(2)结合蛋白质:
结合蛋白质(conjugatedprotein)由简单蛋白质和辅助成分组成,其辅助成分通常称为辅基。
根据辅基的不同,结合蛋白质可分为5类:
核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和金属蛋白。
3、按功能将蛋白质分为10类。
(1)酶:
酶是具催化活性的蛋白质,是蛋白质中种类最多的类群,新陈代谢的每一步反应都是由特定的酶催化完成的。
(2)调节蛋白:
许多蛋白质具有调控功能,这些蛋白质称为调节蛋白。
其中一类为激素,如调节动物体内血糖浓度的胰岛素,刺激甲状腺的促甲状腺素,促进生长的生长素等。
另一类可参与基因表达的调控,它们能激活或抑制基因的转录或翻译。
(3)贮存蛋白质:
有些蛋白的生物功能是贮存必要的养分,称贮存蛋白。
例如,卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮源。
许多高等植物的种子含高达60%的贮存蛋白,为种子的发芽准备足够的氮素。
铁蛋白能贮存铁原子,用于含铁蛋白如血红蛋白的合成。
(4)转运蛋白质:
主要有两类,一类存在于体液中,如血液中的血红蛋白转运氧气,血清蛋白转运脂肪酸。
另一类为膜转运蛋白,能在膜内形成通道,被转运的物质经它进出细胞。
(5)运动蛋白:
生物的运动也离不开蛋白质,如肌肉收缩是由肌球蛋白和肌动蛋白的相对滑动来实现的,细胞内的细胞器移动是通过细胞骨架的某些蛋白质实现的。
(6)防御蛋白和毒蛋白:
有些蛋白质具有防御和保护功能,如抗体能够与相应的抗原结合而排除外来物质对生物体的干扰。
凝血酶作用于血纤蛋白原使血液凝固,防止血液的流失。
南极和北极的鱼含有的抗冻蛋白能防止低温下血液冷冻,病毒外壳蛋白可保护其核酸免遭破坏。
毒蛋白包括动物毒蛋白,蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋白,植物毒蛋白,如蓖麻毒蛋白。
细菌毒素蛋白,如白喉毒素和霍乱毒素。
(7)受体蛋白质:
是接受和传递信息的蛋白质,如激素的受体。
(8)支架蛋白:
能通过蛋白-蛋白相互作用将多种不同的蛋白质装配成复合体,参与激素和其他信号分子胞内应答的协调和通讯,锚定或导向。
如SH2组件(即肉瘤病毒Src蛋白及其家族成员中的SH2结构域)能与含有磷酸化酪氨酸残基的蛋白质结合,SH3组件能与富含脯氨酸残基的蛋白质结合。
(9)结构蛋白:
用于建造和维持生物体结构的蛋白质称为结构蛋白,这类蛋白质多数是不溶性纤维状蛋白质,如构成毛发、角、甲的α-角蛋白,存在于骨、结缔组织、腱、软骨组织和皮中的胶原蛋白。
(10)异常功能:
某些蛋白质具有特殊的功能,如应乐果甜蛋白有着极高的甜度,可作为人工增甜剂。
昆虫翅膀的铰合部存在一种具有特殊弹性的蛋白质,称节肢弹性蛋白。
某些海洋生物如贝类分泌一类胶质蛋白,能将贝壳牢固的粘附在岩石或其他硬表面上。
蛋白质水解
蛋白质的水解产物为氨基酸,说明氨基酸是蛋白质的基本组成单位。
酸水解:
常用6mol/LHCl回流20h,水解完全,不引起消旋,但色氨酸破坏,羟基氨基酸部分水解,酰胺键水解。
碱水解:
蛋白质与5mol/L的NaOH共煮10~20h,也可完全水解,会引起消旋,但色氨酸不破坏。
酶水解:
水解不完全,不引起消旋,色氨酸不破坏,主要用于蛋白质的部分水解。
氨基酸混合物的分析分离
(1)纸层析
Rf主要与R基的极性有关,溶剂的pH可影响R基的极性,氨基酸与滤纸的吸附作用也影响Rf。
(2)离子交换层析
(3)高效液相层析
蛋白质的沉淀反应
蛋白质由于带有电荷和水膜,因此在水溶液中形成稳定的胶体。
如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂,破坏了蛋白质的水膜,或中和了蛋白质的电荷,蛋白质就会从胶体溶液中沉淀出来。
有多种方法可以促进蛋白质的沉淀,有些温和的方法可以将非变性的蛋白质沉淀出来,一些强烈的方法则可以使蛋白质变性沉淀。
①加高浓度盐类用硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等中性盐使蛋白质产生沉淀称盐析法(saltfractionation)。
盐析法沉淀的蛋白质不变性,常用于分离制备有活性的蛋白质。
不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同,因此调节盐浓度,可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出,这种方法称为分段盐析。
例如血清中加硫酸铵至50%饱和度,则球蛋白先沉淀析出,继续再加硫酸铵至饱和,则清蛋白(白蛋白)沉淀析出。
②加有机溶剂酒精、丙酮等有机溶剂和水有较强的作用,可破坏分子水膜,使蛋白质沉淀。
溶液的pH在等电点时,沉淀效果更好。
在低温条件下,用有机溶剂沉淀的蛋白质一般不变性,且沉淀的效果比盐析法好。
有些结构稳定的蛋白质,如超氧化物歧化酶(SOD),在较高温度下用有机溶剂沉淀也不变性。
③加重金属盐类蛋白质在碱性溶液中带负离子,可与氯化高汞、硝酸盐、醋酸铅、三氯化铁等重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
重金属盐类沉淀的蛋白质是变性的,但沉淀的效率很高,常用于除去样品中蛋白质杂质。
④加某些酸类苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质形成不溶解的盐而使其快速沉淀。
沉淀的蛋白质是变性的,常用于沉淀去除样品中的蛋白质杂质。
⑤加热加热可以使大多数蛋白质变性沉淀,是去除样品中蛋白质杂质的常用方法。
不过,有些蛋白质在加热变性后并不沉淀,如乳品中的蛋白质。
18、蛋白质的含量测定
测定可溶性蛋白的含量,除上述双缩脲法和酚试剂法外,常用的方法还有:
①考马斯亮蓝染色法蛋白质可用考马斯亮蓝在室温下染色,反应迅速,约2min可完成,生成物稳定,测定蛋白质含量的灵敏度较高,近年来被广泛使用。
②紫外吸收法由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm左右有强烈的光吸收,可用这一性质测定溶液中的蛋白质含量。
此法不需要任何反应,直接测定蛋白质溶液的A280nm和A260nm,用下列公式可算出蛋白质浓度:
蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280nm-0.47A260nm
这一方法准确度不很高,但是十分简单方便,在分子生物学实验中常用。
③凯氏定氮法测定包括可溶性蛋白和不溶性蛋白的总蛋白含量,只能用本章2.1.1介绍的凯氏定氮法,这一方法的缺点是不能区分蛋白氮,和非蛋白有机氮,计算时,将所有的有机氮均看作蛋白氮,因此,将计算出的蛋白含量称作粗蛋白含量。
此外,计算时所用的系数6.25对某些蛋白质是不合适的,需要用校正后的系数。
不过,测定总蛋白含量,尚未找到取代凯氏定氮法的更好方.法。
④其他方法微量的可溶性蛋白还可用胶体金法和免疫学方法测定,有活性的蛋白质,如酶和激素,可直接测定其生物学活性。
对蛋白质混合物进行凝胶电泳后染色,再进行扫描分析,或用图像分析系统分析照片,可以测定各种蛋白质成分的相对含量。
蛋白质的分离和分析技术
(1)根据蛋白质溶解度不同进行分离
①盐析蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。
硫酸铵溶液的pH常在4.5~5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入透析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。
此外也可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析的办法除盐,所需时间较短。
②等电点沉淀法蛋白质在等电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法和有机溶剂沉淀法结合使用。
③低温有机溶剂沉淀法常用可以与水混溶的有机溶剂如乙醇或丙酮去除蛋白质的水膜,同时,将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀,此法沉淀效率比盐析法高,但蛋白质较易变性,只用于分离某些较稳定的蛋白质,并应在低温下进行。
作用机理:
降低水溶液的介电常数,使溶质溶解度降低;
破坏大分子周围水膜,使溶解度降低。
经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。
优点:
比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离,分辨力比盐析法好,溶剂也容易除去。
注意:
①有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性,所以操作必须在低温条件下进行。
沉淀分离后,应立即用水或缓冲液溶解,以降低有机溶剂浓度。
②样品浓度过大,易变性,共沉淀作用大,分离效果差;
过小,易产生变性,回收率低。
③在样品稳定结构范围内,选择溶解度最低处的pH,即与等电点沉淀结合使用。
④中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性,提高分离效果,一般添加0.05mol/L的中性盐。
由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度,故中性盐不宜添加太多。
注意离子强度,离子种类的影响。
(2)根据蛋白质分子大小进行分离
①透析与超滤
透析法是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖和氨基酸等分开。
超滤法是利用高压力或离心力,迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的滤膜截留不同分子质量的蛋白质。
现在已有各种市售的超滤膜装置可供选用,有加压、抽滤和离心等多种形式。
滤膜也有多种规格,他们截留相对分子质量不同的蛋白质。
使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,使超滤速度减慢,能被截留物质的Mr变小。
超滤的主要应用:
浓缩:
使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度,即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过,从而达到浓缩的目的。
梯度分离:
按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时,超滤是一种经济有效的方法,适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。
在超滤过程中,虽然截留的大分子被浓缩,但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。
脱盐/纯化:
脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。
通过溶剂交换,可最有效地去除溶液中的小分子物质,并逐渐分离纯化出大分子物质。
具体方法为:
在溶液进行超滤的同时,不断向溶液中补充溶剂,补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同,使体系始终保持恒定,这种方法又称透析超滤法。
②凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。
其要点是,用凝胶颗粒填装层析柱,将蛋白混合物加到柱上进行洗脱时,大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙移动,现被洗脱出来,小分子可以进入凝胶颗粒内部后被洗脱出来,从而使各种蛋白质得以分离。
常用的填充材料是葡聚糖凝胶(Sephadexgel)和琼脂糖凝胶(agarosegel),近年来常用的Sephacryl等新型凝胶有更好的强度和稳定性,分别率更好。
③密度梯度离心
(3)根据蛋白质带电性质进行分离
①电泳法
现时常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以因不同蛋白质所带电荷的差异(电荷效应),和大小差异(分子筛效应)高分别率地分离或分析蛋白质。
在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠(SDS),消除蛋白质所带电荷的差异,构成的SDS-P
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