植物组织培养的一些注意重点事项Word文档格式.docx

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①H培养基础培养基大量元素约为MS培养基二分之一,仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低,微量元素种类降低,而含量较MS为高,维生素种类比MS多。

适于花药培养。

②尼奇培养基（Niotsch1969）此培养基与H培养基成份基础相同,仅生物素比H培养基高10倍。

也适合于花药培养。

③米勒培养基（Miller1963）此培养基和Blaydes（1966）培养基二者成份完全相同。

适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。

4、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。

有以下多个:

①改良怀特培养基（White1963）

②WS培养基（Wolter&

Skoog1966）

③克诺普液（Knop1965）花卉培养上用得多。

④贝尔什劳特液（Berthelot1934）

⑤HB培养基（Holley&

Baker1963）此培养基在花卉脱毒培养和木本植物茎尖培养中效果良好。

其成份是大量元素比1/2克诺普（Knop）液稍多,微量元素用贝尔什劳特液,每升培养基中加0.5ml。

二、与培养基相关部分细节问题

1、培养基所用药品应采取等级较高化学纯CP（三级）及分极纯AR（二级）,以免杂质对培养物造成不利影响。

2、调整PH也可用精密pH试纸（应在干燥器中保留,以免吸湿而失效）。

培养基过酸可用1mol/L氢氧化钠（NaOH）来调整;

培养基过碱可用1mol/L盐酸（HCl）来调整（1mol/LNaOH配制方法是称40gNaOH,溶解后加入蒸馏水,定容到1000ml即可。

1mol/LHCl配制方法是量取12mol/LHCl84ml,加水定容至1000ml）。

经高压蒸汽灭菌后,因为一些成份分解（如蔗糖分解）或氧化,酸度会增加（pH值通常可降低0.2）。

有时玻璃器皿质量较差,其中一部分物质溶解,也会影响酸度改变。

这些在调整pH值时都要考虑进去。

分装后应立刻灭菌,若因故不能立刻灭菌,最好放入冰箱中在24h内完成灭菌工作。

灭菌时压力表读数为0.8kg/cm2～1.1kg/cm2,121℃时保持15min～20min即可。

3、一些生长调整物质,如吲哚乙酸、玉米素及一些维生素等物质遇热不稳定,所以不能进行高压灭菌,而需用过滤方法灭菌,经过滤灭菌溶液,可在琼脂培养基温度下降到大约40℃时加入到已高压灭菌培养基中。

4、配好培养基可放到培养室中预培养3d,若没有污染反应,则证实是可靠,能够使用。

临时不用培养基最好置于10℃下保留,含有生长调整物质培养基在4℃～5℃低温下保留则更理想。

含吲哚乙酸或赤霉素培养基应在配制一周内用完,其她培养基至多也不能超出一个月。

通常情况下,两周内应用完,以免干

燥变质。

三、培养材料及消毒

1、取材季节影响:

大多数植物应在其生长开始季节采样,生长末期或已进入休眠期,则外植体对诱导反应迟钝或无反应。

2、器官生理状态和发育年纪:

沿植物主轴,越向上部分所形成器官其生长时间越短,其生理年纪也越老,越靠近发育上成熟,越易形成花器官。

反之,越向下,其生理年纪越小。

木本植物组织培养中,以幼龄树春梢嫩枝段或基部萌条很好,下胚轴与含有3对～4对真叶嫩茎段,生长久有效果也很好。

通常情况下,幼年组织比老年组织含有较高形态发生能力。

3、材料大小影响:

材料越小成活率越低,茎尖培养存活临界大小应为一个茎尖分生组织带1个～2个叶原基,约0.2mm～0.3mm大小。

叶片、花瓣等约为5mm2,茎段则长约0.5mm。

所以,除非用于去除病毒不然不宜将外植体切过小。

但并不是说外植体越大越好,外植体过大易造成污染,有试验证实外植体越大污染率越高。

4、材料灭菌:

通常是组织越大越易污染,夏季比冬季带菌多,甚至不一样年份污染情况也有区分。

取材最好选在中午或下午,避开阴雨天取材可降低污染率。

消毒是为了消亡病菌,以确保无菌组织培养进行。

但不一样植物及一株植物不一样部位组织,其带菌程度不一样,它们对不一样种类、不一样浓度消毒剂敏感度也不一样。

最初所使用消毒剂种类,浓度及消毒时间长短都要进行探索,以达成最好消毒效果。

材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80,对与难消毒根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压,以帮助消毒液渗透,从而达成根本灭菌目。

潘学峰等（1998）报道,12%双氧水+0.1%升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min效果最好。

四、材料接种

1、接种室消毒:

植物组织培养技术实际上是一个无菌操作和无菌培养技术,做好接种室消毒是至关关键。

污染关键起源是空气中细菌和真菌孢子,所以,每次接种前应进行地面清洁卫生工作,并用70%酒精喷雾使空气灰尘沉降,并用紫外线灯照射20min。

接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定时清洗过滤膜,以延长使用寿命。

2、无菌操作要求:

工作人员使用工作服、帽子、口罩等,要常常保持洁净,并定时进行消毒,立即洗净、晾干衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。

工作人员头发、衣服、手指中都带有很多杂菌,为此要穿上工作服,戴上帽子,也必需剪除指甲,并用肥皂擦洗,最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10

min,接种操作前则用70%酒精擦洗。

工作人员呼吸所产生污染,关键是

在接种时谈话或咳嗽所引发,所以,在操作时应严禁谈话并应戴上口罩。

3、材料分离、切取和接种

切割动作要快,预防挤压使材料受损伤而招致培养失败,也要避免使用生锈刀片,以预防氧化现象产生。

接种时要预防交叉污染发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%（或95%）酒精中浸泡,然后灼烧放凉备用。

接种时轻轻取下封口纸,动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染。

将瓶口靠近酒精灯火焰,瓶口倾斜,以免空气中微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟,将灰尘杂物等固定在原处,然后用镊子将外植体送入瓶中,材料在培养容器内分布要均匀,以确保必需营养面积和光照条件。

茎尖、茎段等基部插入固体培养基中,叶片通常将叶背接触培养基,这是因为叶背气孔多,利于吸收水分和养分缘故。

五、材料初代培养

1、试验方案设计

1）、单因子试验设计:

单因子试验是组织培养中最常见试验方法,尤其在选择合适激素种类和浓度配比上使用最多。

2）、正交试验设计植物离体培养成功是由多个原因决定。

正交设计是多原因分析有力工具,它能够很方便从众多原因中选出关键影响原因及最好水平,因为它能够用较少试验次数得到较多信息。

比如,一个7原因水平试验,若将各原因水平全部组合都做一遍,需要27=128次,而正交设计只需做8次试验就能够了,即使试验次数降低了,但因为各原因水平搭配均匀,8次试验基础代表了全部试验情况。

正交试验设计,关键工具是正交表。

大多数生物统计学书都列出了可供选择正交表,如L4（23）,L8（27）见（表2-11,表2-12）。

字母L右下角号码8表示它有8个试验要做,括号内指数7表示这张表所安排试验最多可考察7个原因（也可安排2个～6个,超出7个要选择其她正交表）,底数2表示被考察原因只要求两个水平。

在进行试验前可依据要测试原因多少及每种原因所考察水平,选择适合正交表,然后按表进行试验。

现举一个例子来说明,设影响某种植物试管苗生长原因有光照时间、光照强度、pH值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA浓度7个原因,每个原因选择两个水平,即,光照时间（10h,14h）、光照强度（1000lx,lx）、pH值（5.5,5.8）、温度（20℃,25℃）、BA浓度（0.5,2.0）、NAA浓度（0.5,1.0）、蔗糖浓度（2%,4%）。

现依据原因和水平多少选择一个适合本试验正交表,选L8（27）最理想,填表时,原因水平对号入座,见表（2-13）。

第一号试验是光照时间10h/d、光照强度1000lx、pH值5.5、BA浓度2.0、NAA浓度0.5、蔗糖浓度4%,其她试验依次类推。

依据8个试验结果,如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等,综合考虑,依据需要选择各最适培养条件。

也可经过一定计算方法（参考统计学书）,算出极差（R）,极差（R）表示每个原因在试验中所起作用大小,R越大表示该原因不一样水平对试验结果影响越大,但若没有可计算指标时,还是选择单因子试验很好。

2、初代培养物建立

1）、确保无菌

2）、条件适宜:

首先,一定要选择好适宜作物种类、品种及培养部位;

其次,一定要选择适宜培养基,激素及其她添加物;

还要注意掌握适宜环境条件。

所以在进行一个植物组织培养之前,应查找该种植物相关方面资料,依据这种植物过去所采取培养部位、培养基、培养条件和培养技术等,再决定自己工作步骤。

3）、操作技术过关

3、污染防治

1）、植物材料选择及预防污染

通常多年生木本材料比一二年生草本材料带菌多;

老材料比幼嫩材料带菌多;

田间生长材料比温室生长材料带菌多;

带泥土材料比不带泥土材料带菌多。

为此对于培养材料取材就应很认真地加以选择,以降低污染发生。

用茎尖作外植体时,应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。

将枝条用水冲洗洁净后插入无糖营养液或自来水中,使其发枝,然后以这种新抽嫩枝条作为外植体,便可大大降低材料污染。

或在无菌条件下对采自田间枝条进行暗培养,待抽出徒长黄化枝条时取材,也可显著地降低污染。

对木本植物等难以消毒材料可采取数次灭菌法。

如将切好外植体放入1.3%次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%溶液）消毒30min,然后用无菌水冲洗3次,再放在无菌条件下,次日用2.6%次氯酸钠灭菌30min,然后用无菌水冲洗3次。

也可采取多个药液数次浸泡法,以加强灭菌效果。

材料内部易感染病菌,在这种情况下,必需在培养基中加入抗生素类,预防初代培养物污染。

2）、人为污染预防

接种前应用肥皂将手仔细洗净后,再用70%酒精擦洗双手,并需立刻剪除指甲。

在工作中尤其要注意避免交叉感染,双手必需清洁,工具则用一次即需消毒一次。

工作人员呼吸所产生污染,关键是接种时说话或咳嗽所引发,所以,操作时严禁谈话,并应