E2APBX1融合基因阳性的儿童急性淋巴细胞白血病携带变异型融合转录本Word格式文档下载.docx
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结论:
携带E2A-PBX1融合基因的儿童ALL表达典型和变异型2种融合转录本,后者是由E2A基因第13外显子被差异剪切而形成的,它将导致融合蛋白中53个氨基酸残基及其所构成的部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。
【关键词】急性淋巴细胞白血病
VariantFusionTranscriptinALLChildrenwithE2A-PBX1FusionGenePositive
AbstractThestudywasaimedtoinvestigatetheexpressionofE2A-PBX1fusiongeneinchildrenwithacutelymphoblasticleukemia(ALL).TheprimerslocatedatdifferentsitesofE2AandPBX1genewereusedtoscreenforthefusiongenein410childrenwithALL,including362casesofBcellALLand48casesofTcellALL.Theresultsshowedthat17childrencarriedthefusiongene.Thepositiveratewas4.1%.Furthermore,allthepositivecasesexpressedavarianttypeoffusiontranscript.Itresultedfromdifferentsplicingofthe13thexon(159bp)ofE2Agene.AnalyseswithBLASTnindicatedthatthevarianttypeoftranscriptretainedtheopenreadingframe.However,thelossof53aminoacidresidueswhichwerelocatedatthe2ndactivationdomainresultedinthepartialdeletionoftheputativeloop-helix(LH)structureaswellasthecompletedeletionoftheheptadleucinerepeat.ItisconcludedthatallthechildrenwithALLpositivefortheE2A-PBX1fusiongeneexpresstypicalandvariantfusiontranscripts.Thelatterresultedfromdifferentsplicingofthe13thexon(159bp)ofE2Agene.Thelossof53aawouldleadtothepartialdeletionoftheputativeloop-helix(LH)structureaswellasthecompletedeletionoftheheptadleucinerepeat.
KeywordsALL;
E2A-PBX1fusiongene;
varianttypeoffusiontranscript;
2ndactivationdomain
t(1;
19)(q23;
p13.3)易位及其形成的E2A-PBX1融合基因是急性淋巴细胞白血病(ALL)中常见的染色体畸变及基因异常,大约5%的儿童[1-3]和3.3%的成人[4]ALL携带这种异常染色体。
早期的研究认为,t(1;
19)易位与治疗早期的复发相关,更为强烈的化疗能够抵消这种效应[1,2]。
最近的研究证明,治疗方案的改进已使携带t(1;
19)易位的儿童ALL预后极大改善,5年无白血病活存率已达89.5%[5]。
在本研究中,我们利用两套PCR引物,研究了儿童ALL的E2A-PBX1融合基因表达。
发现所有携带E2A-PBX1融合基因的患儿除具有典型融合转录本外,全部携带一种变异型融合转录本。
材料和方法
病例
从2000年12月至2004年12月我院共收治410例儿童ALL,其中包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL。
所有患儿均行骨髓细胞形态学、细胞化
学染色及免疫学检查,部分患儿进行细胞遗传学检查。
我们采用多重巢式RT-PCR方法[6]在17例患儿检出E2A-PBX1融合基因,检出率4.1%。
17例患儿中,男6例,女11例,年龄11个月到12岁,中位年龄7岁。
方法
标本
抽取初诊患儿的1ml骨髓液,EDTA-K2抗凝。
采用红细胞裂解液(含0.1%KHCO3、0.83%NH4Cl、0.0037%EDTA-Na2)裂解红细胞。
约106单个核细胞用于提取细胞总RNA。
提取细胞总RNA及逆转录反应
采用TRIZOLReagent(购自美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA。
利用MMLV逆转录酶及随机六聚体(购自美国Promega公司)为引物将RNA逆转录为cDNA,-20℃冻存备用。
对照基因ABL的扩增
为避免RNA降解造成的假阴性,以ABL基因作为对照。
引物序列和扩增条件分别见参考文献[7]和[8]。
E2A-PBX1融合基因的巢式PCR扩增
①典型融合转录本的扩增:
引物序列[9]和位置分别见表1和图1。
PCR扩增条件包括:
25μl反应体系,含有10mmol/LTris·
HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,0.2mmol/LdNTPs,1.5mmol/LMgCl2,3.75pmol引物,2μlcDNA(第1轮反应)或1μl第1轮PCR产物(第2轮反应),1UTaqDNA聚合酶。
93℃预变性3分钟,93℃变性40秒,51℃退火45秒,72℃延伸40秒,共35个循环,最后72℃延伸10分钟。
②变异型融合转录本的扩增:
引物序列[10]和位置分别见表1和图1。
25μl反应体系,含有10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,0.2mmol/LdNTP,1.32mmol/L(第1轮反应)或1.44mmol/L(第2轮反应)MgCl2,5pmol(第1轮反应)或6.25pmol(第2轮反应)引物,2μlcDNA(第1轮反应)或1μl第1轮PCR产物(第2轮反应),1UTaqDNA聚合酶。
95℃预变性5分钟,95℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸1分钟,共25个循环,最后72℃延伸10分钟。
Table1.PrimersusedtoamplifyE2A-PBX1fusiontranscripts(略)
聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色按照本室的常规方法进行。
PCR产物的测序
取100μl的变异型E2A-PBX1扩增产物送上海博亚公司,采用PE公司ABI377型测序仪,利用E2A-4和PBX1-4两条引物从双向测定DNA序列。
将DNA序列输入BLASTn进行序列比对。
结果
E2A-PBX1融合基因和ABL基因的扩增
根据文献报道,采用E2A-1、PBX1-1、E2A-2和PBX1-2进行巢式PCR,可以获得典型融合转录本扩增片段[9]。
我们的结果证实了上述结论,阳性片段大小为159bp。
电泳结果见图2A。
根据文献报道,采用E2A-3、PBX1-3、E2A-4和PBX1-4进行巢式PCR,可以获得典型融合转录本扩增片段,大小为376bp[10]。
我们的结果除获得376bp的阳性片段外,尚可见217bp的片段。
电泳结果见图2B。
所有标本均可见ABL基因扩增片段。
电泳结果见图2C。
变异型融合转录本扩增片段的测序和BLASTn比对
测序结果见图3。
将双向测序结果加以拼接,并输入BLASTn进行比对分析,发现该片段是由E2A基因的第13外显子(159bp)剪切所形成。
剪切并未影响PBX1基因和开放阅读框,因此没有形成移码突变。
典型与变异型序列的比较见图4。
讨论
t(1;
19)易位在衍生19号染色体上形成了E2A-PBX1融合基因。
在mRNA水平,由E2A基因的第14外显子和PBX1基因的第12外显子相连接形成融合转录本[11]。
目前已发现2种E2A-PBX1转录本,编码2种融合蛋白,P85和P77,二者只在PBX1部分的羧基端存在差异,并都具有转化特性,属于癌蛋白[11]。
本研究发现的变异型融合转录本是由E2A基因的第13外显子被差异剪切掉形成的,若要检测出这种转录本,所用E2A引物必须位于第12外显子及其上游。
文献中用于扩增E2A-PBX1融合转录本的引物较多,其中E2A引物大多位于第13或14外显子,少数位于第12与13外显子交界处。
本研究使用的E2A-1位于第12-13外显子交界处,其3’端有13个碱基位于第13外显子内,E2A-2位于第13-14外显子交界处,其5’端有12个碱基位于第13外显子内,因此只能扩增出典型融合转录本。
而E2A-3和E2A-4均位于第12外显子,因此能够同时扩增出典型和变异型两种融合转录本。
另一方面,测序结果也证实了变异型转录本的存在。
综合两套引物的检测结果,可以认为所有患儿的白血病细胞都同时表达两种融合转录本。
至于使用E2A-3和E2A-4只在5例患儿中检出典型融合转录本,其余患儿只能检出变异型转录本,可能是由于我们采用的PCR条件更适于变异型转录本的扩增。
E2A基因是淋巴细胞分化的重要调节基因,直接参与免疫球蛋白(Ig)基因重排,调节外周血成熟B细胞的Ig类别转换,同时也在多个阶段参与胸腺细胞的选择与分化[12,13]。
E2A蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族,包含2个活化区,即AD1和AD2[14-16],E2A-PBX1融合蛋白仍保留了这两个活化区。
变异型融合转录本丢失了159bp,但没有影响开放阅读框,没有造成移码突变,因此仍将转录出融合蛋白,但丢失了53个氨基酸。
值得注意的是,缺失的这53个氨基酸恰恰位于AD2区,将导致环-螺旋结构的部分丢失和七聚体亮氨酸重复结构的全部丢失[15,16](图5)。
在HeLa细胞和酵母,环-螺旋结构具有活化功能[16],七聚体亮氨酸重复结构可能参与和其它拉链蛋白的相互作用[15]。
AD2区的完全缺失或七聚体亮氨酸重复结构的前2个亮氨酸的定点突变,将严重损害E2A蛋白的转化功能和/或反式活化
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- E2APBX1 融合 基因 阳性 儿童 急性 淋巴细胞 白血病 携带 异型 转录
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