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(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。
取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。
在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 ,
从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。
解析:
(1)EcoRⅠ酶切目的基因和载体,在切口处形成粘性末端;
DNA连接酶使具有相同粘性末端的两个片段形成磷酸二酯键,能获得重组
质粒。
(2)目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。
经转化的农杆菌,在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,以使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。
(1)粘性末端 磷酸二酯键
(2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态
1.基因工程的工具
2.基因工程的原理与操作步骤
(1)基因工程的原理
①基本原理:
让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。
②基本要素:
多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。
(2)基因工程的基本操作步骤
3.形成重组DNA分子
(1)单酶切法
将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片段混合,加入DNA连接酶,两两连接的产物(重组DNA分子)有以下3种:
目的基因与目的基因的连接物;
质粒与质粒的连接物;
目的基因与质粒的连接物。
其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。
(2)双酶切法
双酶切法的优点主要在于防止质粒和目的基因自身环化以及保证目的基因单向插入质粒。
【自我诊断】
1.转入外源基因的动物称为转基因动物。
( √ )
2.从猪血液中提取的胰岛素属于基因工程药物。
( ×
)
3.限制性核酸内切酶作用于DNA分子的氢键,使DNA双链断开。
4.限制性核酸内切酶能够特异性识别并切割烟草花叶病毒遗传物质。
5.基因工程的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及质粒。
6.质粒中的抗生素合成基因等标记基因通常会用于含有目的基因受体细胞的筛选。
7.质粒是一种直链DNA分子,可作为基因工程中的载体。
8.DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是基因工程中常用的两种工具酶。
9.土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组,然后将重组DNA分子导入植物受体细胞。
10.基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表达。
11.多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素。
12.目的基因序列未知,可采用PCR扩增获得目的基因。
13.构建基因文库时需包含目的基因。
14.将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法。
15.利用氯化钙处理农杆菌细胞,可以增加其细胞膜的通透性。
16.在宿主细胞中检测到目的基因存在,说明转基因技术操作成功。
17.限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要手段。
18.基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因。
考向1 基因工程的工具
【例1】下列关于基因工程的有关叙述,正确的是( )
A.基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体
B.一种限制性核酸内切酶能识别几种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA
C.质粒是一种常用载体,是拟核外能自主复制的很小的环状DNA分子
D.DNA连接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的复制
基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶,载体是工具;
一种限制性核酸内切酶能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA;
质粒是独立于拟核区之外的特殊环状DNA分子,具有自主复制能力;
DNA聚合酶以DNA的一条链为模板进行复制,DNA连接酶不需要模板,将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起,形成重组DNA分子。
C
基因工程操作中的6点易错
(1)在切割目的基因时要求用同一种限制性核酸内切酶,目的是产生相同的粘性末端。
(2)将目的基因从DNA分子中切割出来需要消耗4分子水,形成4个粘性末端,目的基因上含有2个粘性末端。
(3)不同DNA分子用相同限制性核酸内切酶切割产生相同的粘性末端,同一种DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割,产生的粘性末端一般不同。
(4)基因工程中用到的载体并非只有质粒,还有λ噬菌体、植物病毒和动物病毒,其中质粒和λ噬菌体可将外源基因载入到大肠杆菌等宿主细胞中,而植物病毒和动物病毒能够将外源基因分别载入到植物细胞和动物细胞内。
(5)基因工程中载体与细胞膜上载体本质不同,前者化学本质为DNA,后者为蛋白质。
(6)标记基因与目的基因的表达无关,其作用为筛选含有目的基因的受体细胞。
考向2 基因工程中形成重组DNA分子的形成方式
【例2】如表所示列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。
下列说法错误的是( )
限制酶
BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
SmaⅠ
识别序列及
切割位点
A.一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后,含有4个游离的磷酸
基团
B.用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割
C.图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRⅠ
D.为了获取重组质粒,最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA
质粒切割前是双链环状DNA分子,所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键,故不含游离的磷酸基团。
从图1可以看出,质粒上只含有一个SmaⅠ的切点,因此被该酶切割后,质粒变为线性双链DNA分子,因每条链上含有一个游离的磷酸基团,因此切割后含有两个游离的磷酸基团;
重组DNA分子中应具备目的基因、标记基因等,图中质粒的标记基因为抗生素抗性基因,而SmaⅠ的切割位点就在该基因上,因此用质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割;
由于同种限制性核酸内切酶切割形成的粘性末端相同,图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRⅠ;
使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA,各自会有不同粘性末端,能防止自身环化。
A
考向3 基因工程的应用
【例3】(2018·
浙江全能生9月联考)重瓣紫堇具有较高观赏和药用价值,但自然状态下几乎高度不育。
为解决重瓣紫堇的繁殖难题,科学家利用另一种植物的可育基因M,完成了对重瓣紫堇的改造,流程如图:
(图中箭头指的是不同限制性核酸内切酶识别的位点)
请回答:
(1)在本例中,应选用的限制性核酸内切酶是 ,以避免质粒自身环化、错向连接等问题。
连接目的基因和质粒时,关键需要催化 键的形成。
(2)导入受体细胞时,应先用CaCl2处理 ,使其 ,从而有利于重组质粒的导入。
(3)利用紫堇根尖细胞培养成完整植株,依据的原理是
,理论上, (填“能”或“不能”)用紫堇的叶肉细胞代替根尖细胞完成上述改造工作。
(4)若图中所得的转基因紫堇植株自交一代,子代中能稳定遗传的个体所占的比例为 。
(1)根据质粒和目的基因所在DNA均存在三个限制性核酸内切酶切位点,且BalⅠ酶切位点处于目的基因M的中间,不适宜选用,因此应该选择HindⅢ和XhoⅠ进行酶切,且符合题中“避免质粒自身环化、错向连接”等问题;
目的基因与质粒的连接需要DNA连接酶,具体催化的化学键是磷酸二酯键。
(2)本题采用的是农杆菌转化法,其中重组质粒首先导入的受体细胞为农杆菌,再借助农杆菌侵染植物细胞的特性,将农杆菌细胞内的目的基因转移至最终的植物细胞中,因此CaCl2处理的对象是农杆菌,其具体机理是使得细菌处于感受态。
(3)植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性,由于叶肉细胞同样具有本物种生长、发育、繁殖的全部遗传信息,所以也可作为受体细胞进行培养。
(4)该转基因植物可写作“MO”型,在自交时,相当于杂合体,会导致后代性状分离,具体为MM∶MO∶OO=1/4∶1/2∶1/4,因此可稳定遗传的植株基因型为MM,占1/4。
(1)HindⅢ和XhoⅠ 磷酸二酯
(2)农杆菌 处于感受态
(3)植物细胞的全能性 能
(4)1/4
基因工程中分子或个体水平的检测方法
【热点变式】人血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值。
如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。
(1)如果HSA基因序列未知,可以采用 的方法获取该目的基因,为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建 后才能导入宿主细胞。
(2)方框中的“?
”一般选用的生物是 ,为了提高Ⅱ过程的导入成功率,通常用 处理大肠杆菌。
(3)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择 (填“Ⅰ”或“Ⅱ”)途径获取rHSA更有优势。
(4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA,可以用 方法来进行检验。
A.检验HSA基因是否导入
B.检验细胞中是否产生相应的mRNA
C.抗原—抗体杂交
D.检测是否有标记基因
(1)获取目的基因的方法有:
从基因文库中获取、采用PCR技术扩增(适用于目的基因的核苷酸序列已知的情况下)、人工化学合成(适用于目的基因较小且序列已知的情况下)。
因此如果HSA基因序列未知,可以采用从基因文库中提取的方法获取该目的基因;
为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建基因表达载体(重组DNA)后才能导入宿主细胞。
(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,因此方框中的“?
”一般选用的生物是农杆菌;
将目的基因导入微生物细胞时常用感受态细胞法,即用氯化钙处理微生物细胞,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。
(3)由于大肠杆菌是原核生物,其细胞中不含内质网和高尔基体,而人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择Ⅰ途径获取rHSA更有优势。
(4)检测目的基因是否表达形成蛋白质可以采用抗原-抗体杂交法。
(1)从基因文库中提取 重组DNA分子
(2)农杆菌 氯化钙 (3)Ⅰ (4)C
考点2 克隆技术
1.(2018·
浙江4月选考,节选)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行 ,然后接种到培养基中培养,幼胚发生 形成愈伤组织,并进行继代培养。
用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。
影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:
培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及
(答两点即可)。
组织培养时对幼胚先进行消毒处理,以免污染;
幼胚经脱分化形成愈
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