微生物检测方法USPWord格式.docx
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如果因此而是用了钝化剂,则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
如果在处理样品时使用了表面活性剂,必须证明其对微生物无毒性及与证明
其所使用的钝化剂的兼容性。
计数方法
用薄膜过滤法和平皿计数法。
最大机率法(MPN)一般来说最不准确的微
生物计数方法。
但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方
法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。
所选
随意编辑
择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。
必须证明所选择
的方法的适用性。
生长促进试验、计数方法的适用性和阴性对照
一般原则
必须证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物。
如果在检测
过程中有了改变或会影响检测结果的产品的改变,则必须证明其适用性。
测试菌株的准备
用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法准备测试菌株。
使用
菌种培养维护技术(菌种系统),以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物
不大于5个片段。
按照表1中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进行
培养。
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲液来配制测试混
悬液;
制备A.brasiliensis孢子混悬液,可加入0.05%的聚山梨酯80。
在2小
时内使用该混悬液或如果在2°
-8°
储存则在24小时内使用。
作为一种替代的方
法,可以配制并稀释植物细胞A.brasiliensis或B.subtilisde新鲜混悬液,配
制一份孢子的稳定混悬液,然后用适量的此孢子混悬液进行接种。
此稳定的孢子
混悬液可在2°
在验证过的一段时间内保存。
阴性对照
为了确认检测条件,用稀释剂代替样品溶液进行阴性对照。
阴性对照必须没
有微生物生长。
在检测“产品检测”项下描述的产品时也需要进行阴性对照,阴
性对照失败需进行调查。
培养基生长促进
对每一批准备好的培养基和每一批由脱水培养基或原料制成的培养基进行
检测。
在大豆酪蛋白消化肉汤和大豆酪蛋白消化琼脂部分/培养皿上接种表1中
规定的少量微生物(不大于100CFU),每种培养基使用单独的部分/培养皿。
在
沙氏葡萄糖琼脂培养皿中接种表1中规定的少量微生物(不大于100CFU),每
种培养基使用单独的部分/培养皿。
根据表1中的规定进行培养。
表1.检测微生物的准备和使用
生长促进
产品中计数方法的适用性
微生物
测试菌株
需气菌总
霉菌和酵
霉菌和酵母
的准备
数
母菌总数
菌总数
金黄色葡萄球大豆酪蛋大豆酪蛋
大豆酪蛋
菌
,
如白消化琼白消化琼
白消化琼
ATCC6538
、
脂或大豆
脂和大豆
脂/MPN大
NCIMB9518、
酪蛋白消
豆酪蛋白
CIP4.83、或
化肉汤
消化肉汤
NBRC13276
30°
-35°
≤100CFU
18-24小
时
≤3天
绿脓杆菌,如大豆酪蛋大豆酪蛋
ATCC902
NCIMB8626
CIP82.118
或
NBRC13275
枯草芽孢杆菌,
如ATCC6633、白消化琼
NCIMB8054
CIP52.62
NBRC3134
白色念珠菌,如
沙氏葡萄
沙氏葡萄糖
ATCC10231、
糖琼脂或
糖琼脂
琼脂
NCPF3179
脂
IP48.72
糖肉汤
20°
-25°
NBRC1594
≤5天
2-3天
MPN:
not
applicable
黑曲霉菌,如
ATCC16404、
IMI149007
马铃薯葡
IP1431.83
萄糖琼脂
NBRC9455
30°
5-7天或≤5天
直到有好
的芽孢形
成
对于固体培养基,由一个大于2的因子和由标准化接种物计算值得到的增长
必须相同。
对于新制备的接种物,微生物的生长情况应该和之前一批经过检测并
验证的培养基的情况相比较。
如果与之前一批经过检测并验证的培养基的情况相
比较,微生物的生长情况是明显可见的,那么液体培养基亦适用。
制备样品
制备样品的方法取决于待测品的物理性质。
如果以下程序均不能达到令人满
意的效果,则应开发其他替代的程序。
水溶性待测样品:
在PH7.0的氯化钠-蛋白胨溶液、PH7.2的磷酸盐缓冲液或大
豆酪蛋白消化肉汤中溶解或稀释(通常准备1:
10的稀释液)待测样品,将PH
值调节至6-8。
如果需要进一步稀释,应使用相同的稀释剂。
不溶于水的非脂肪性样品:
在PH7.2磷酸盐缓冲液,PH7.0的氯化钠蛋白胨缓
冲液或大豆酪蛋白酶消化肉汤中制备待测品混悬液(通常按1:
10稀释),可加
入例如1g/L的聚山梨酯这一类表面活性剂来帮助亲水性差的物质形成悬液。
如
果需要调节PH到6-8。
如果需要,可用同样的稀释剂进一步稀释。
脂肪性产品:
用经过除菌过滤后的肉豆蔻酸异丙酯溶解样品,或将样品与最小需
要量的无菌聚山梨酯80或其他加热后的无菌的无抑制性的表面活性剂混合,如
果需要加热,温度应不超过40°
,对特殊的产品,应不超过45°
。
小心混合,如
果需要在水浴中保持此温度。
加入足够量的用预热过的稀释剂进行1:
10稀释后
的待测样品。
小心混合,直至形成乳状液。
用含有适量无菌聚山梨酯80或其他
非抑制性的表面活性剂的稀释剂进行连续的十倍稀释。
气溶胶中的液体或固体:
在无菌条件下将待测样品转移至薄膜过滤器或无菌的容
器中以进行进一步的取样。
使用全部或者每个容器中计算出的剂量作为样品。
透皮贴剂:
移除透皮贴剂的保护层,将其放置在无菌的玻璃或塑料盘中,有粘性
的一面向上,用一层能透气的盖住透皮贴剂的粘性表面以防其粘在一起,然后将
贴剂转移到适量的含有像聚山梨酯80和/或卵磷脂等钝化剂的稀释剂中,大力振
摇至少30分钟。
接种和稀释
向按上述方法制备的样品及对照中(无待测样品)加入适量的微生物混悬液
以得到不大于100CFU的接种物。
接种物的体积应不大于稀释的待测样品的体
积的1%。
为了证明待测样品中可接受的微生物的回收率,必须用样品的最低可能稀释
因子进行检测。
如果由于抗微生物活性或者溶解性差而无法用样品的最低可能稀
释因子进行检测,则必须寻求其他合适的方案。
若不能避免对样品生长的抑制,
在中和、稀释或过滤后应加入等分的微生物混悬液。
中和/移除抗微生物活性
按照“接种和稀释”的规定进行稀释的样品中微生物的回收率及按照“产品
中微生物的回收率”进行培养,与对照中微生物的回收率进行比较:
如果生长被
抑制(由于因子大于2而降低),则变更该计数检测方法的程序以保障结果的有
效性。
变更的程序可包括,例如:
(1)增加稀释剂或培养基的体积;
(2)将特定的或一般的中和剂混入稀释剂中;
(3)薄膜过滤;
上述措施结合。
中和剂:
中和剂用中和样品中的抗微生物活性(见表1)。
最好在灭菌前将
其加入到所使用
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