胶原诱导类风湿关节炎小鼠的重要脏器病理变化Word文档下载推荐.docx
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胶原诱导的DBA/1小鼠,其踝关节呈现严重的病理变化,其肺部也出现明显的炎症,且与类风湿关节炎肺部并发症的病理变化有相似之处,这些结果提示该模型可用于类风湿关节炎肺部病变的相关研究。
【期刊名称】世界科学技术-中医药现代化
【年(卷),期】2018(020)001
【总页数】5
【关键词】类风湿关节炎胶原诱导关节炎模型DBA/1小鼠脏器病理变化
类风湿关节炎是一种慢性、系统性的自身免疫疾病,特征为多关节、对称性、侵袭性关节炎症,多发于手、足小关节,常伴有关节外器官受累[1,2]。
类风湿关节炎病人关节的主要病理特征表现为滑膜增生、关节腔变小、炎细胞浸润、血管翳形成、关节软骨及软骨下骨的破坏等[3,4]。
除了关节的病理变化,还会出现多种关节外病变,例如心脏病变、肺部病变、肾脏损害等[5]。
类风湿关节炎的关节病变一般只能致残,致死罕见,但是关节外的损害有致死的可能。
因此,全面了解类风湿关节炎的关节外表现有利于我们对类风湿关节炎全貌的认识,有利于避免误诊,早期治疗,改善预后。
多种类风湿关节炎动物模型的建立促进了我们对类风湿关节炎发病机制及病理变化的研究和认识,特别是对关节病理的研究,但是利用动物模型研究类风湿关节炎关节外病变的较少。
小鼠胶原诱导关节炎模型在临床表现和病理机制等方面与人的类风湿关节炎有很多相似之处,是研究类风湿关节炎病理机制的较理想模型[6]。
因此,我们采用牛II型胶原混合完全弗氏佐剂诱导DBA/1小鼠,观察小鼠各个重要脏器的病理变化,以期观察该模型是否可用于类风湿关节炎关节外病变的研究。
1实验材料
1.1实验动物
20只DBA/1小鼠,雄性,7-8周,18-22g,SPF级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:
SCXK(京)2012-0001,在恒温(24±
2)℃、光照周期12h环境中饲养。
1.2主要试剂及仪器
主要试剂:
完全弗氏佐剂(Chondrex,Lot:
150034)、牛II型胶原(Chondrex,Lot∶140519)、Mayer苏木素染色液(LEAGENE,Lot∶0911A15)、伊红染色液(LEAGENE,Lot∶0810A15)、UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司,Lot∶CA04KA4108)、PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)(Takara,Lot∶AK3401)、SYBR®
PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)(Takara,Lot∶AK7103)。
主要仪器:
小型高速离心机(eppendorf,型号:
Cen⁃trifuge5430)、涡旋振荡仪(其林贝尔仪器制造有限公司,型号:
QL-902)、荧光定量PCR仪(AppliedBiosys⁃tems,型号:
ABI7500)、包埋机(ThermoScientific,型号:
ShandonHistocentre3)、切片机(ThermoScientific,型号:
ShandonFinesseME+)、展片机(ThermoScientific,型号:
TissueFlotationBath)、烤片机(ThermoScientific,型号:
Hotplate)、正置生物显微镜(LEICA,型号:
DM6000B)、微量紫外分光光度计(ThermoScientific,型号:
Nanodrop2000)。
1.3引物合成及序列
TGF-β1、TNF-α及内参基因GAPDH的上下游引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。
TGF-β1上游引物:
5′-ATTGGCCAGCATCCATCTCTTG-3′,下游引物:
5′-TGCCACCATCATAGACTAG⁃ATTC-3′;
TNF-α上游引物:
5′-AGGCACTCCCCCAAAAGAT-3′,下游引物:
5′-CAGTAGACAGAAGAGCGT⁃GGTG-3′;
GAPDH上游引物:
5′-AGGCCGGTGCTGAG⁃TATGTC-3′,下游引物:
5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。
2实验方法
2.1小鼠胶原诱导关节炎模型的制备
将DBA/1小鼠随机分成2组,分别为正常对照组和模型组,每组10只。
模型组小鼠按以下方法造模:
浓度为2mg·
mL-1的牛Ⅱ型胶原溶液和完全弗氏佐剂以1∶1(体积比)的比例混合,将牛Ⅱ型胶原逐滴加入完全弗氏佐剂中,整个过程在冰浴中进行,边滴边用匀浆器乳化,每转3min,停止1min,直至将乳化剂滴至水中,若不扩散说明已充分乳化。
乳化剂需现用现配,Day0于尾根部皮内注射,100μL/只,Day21用同样的方法加强免疫[7]。
2.2关节炎评分
造模后每周进行一次关节炎评分,评分标准如下:
0分=无红肿;
1分=小趾关节红肿;
2分=趾关节和小趾关节肿胀;
3分=踝关节以下部位肿胀;
4分=整个足爪肿胀(包含踝关节)。
每次记录小鼠四肢的评分,累计最高评分为16分[8]。
2.3病理学观察
于Day63处死小鼠,分离心、肝、脾、肺、肾和踝关节。
将脏器置于10%福尔马林缓冲液中固定,将踝关节剔除周围软组织后置于4%多聚甲醛中固定。
踝关节固定48h后,置于10%EDTA脱钙液中脱钙,以1mL注射器针头能刺入关节骨内为脱钙完全。
将脱钙好的踝关节用不同浓度的梯度乙醇脱水,二甲苯中透明,石蜡包埋,制作病理切片(4μm),经苏木素-伊红(HE)染色后,显微镜下观察各组织病理学变化。
2.4Real-timePCR检测小鼠肺组织中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平
按照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒的说明书提取小鼠肺总RNA,使用Nanodrop2000测量RNA的纯度和浓度。
按照PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒中的说明书将RNA反转录成cDNA。
Real-timePCR按照SYBR®
PremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)试剂盒中的说明书进行操作,扩增程序为:
95℃30sec,(95℃5sec,60℃40sec)×
45个循环,95℃15sec,60℃1min,95℃15sec。
采用2-△△CT法计算目的基因mRNA的相对表达量。
3结果
3.1CIA小鼠体征观察情况
DBA/1小鼠造模成功后,毛发逐渐失去光泽,前肢、后肢陆续出现红肿现象,功能障碍,活动减少,体重下降,Day42-63为肿胀高峰期,发病率达100%。
图1为正常小鼠和CIA发病小鼠的关节比较图。
3.2CIA小鼠关节炎评分结果
CIA小鼠的关节炎评分见图2,分析可知,小鼠于Day28左右开始发病,然后关节炎评分逐渐增高,Day42-63为疾病高峰期,最高评分可达12分。
3.3CIA小鼠踝关节和心、肝、脾、肺、肾的组织病理变化
3.3.1踝关节病理表现
正常小鼠和CIA小鼠的踝关节HE染色病理图见图3,结果显示:
正常小鼠的踝关节结构完整,关节腔内干净,关节表面光滑平整,滑膜细胞1-2层,排列整齐,软骨和骨非常完整。
CIA小鼠的踝关节可见滑膜增生,关节间隙明显变窄,有关节腔积液,大量的炎细胞浸润,血管翳形成,软骨和软骨下骨均有侵蚀现象。
3.3.2心脏病理学表现
正常小鼠和CIA小鼠的心脏HE染色病理图见图4,结果显示:
正常小鼠的心肌组织结构清晰,心肌纤维细长,呈圆柱形,心肌纤维间有少量的结缔组织。
CIA小鼠的心脏病理结果和正常小鼠的相似,没有出现明显的病理变化。
3.3.3肝脏病理学表现
正常小鼠和CIA小鼠的肝脏HE染色病理图见图5,结果显示:
正常小鼠的肝小叶结构清晰完整,肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列,形态结构正常。
CIA小鼠的肝脏未出现异常现象。
3.3.4脾脏病理学表现
正常小鼠和CIA小鼠的脾脏HE染色病理图见图6,结果表明:
正常小鼠的脾脏结构特征清晰完整,白髓和红髓的界限比较明显,能清楚的看到淋巴小结中央动脉以及动脉周围的淋巴鞘,淋巴细胞密集。
CIA小鼠的脾脏没有发现明显的病理变化。
3.3.5肺脏病理学表现
正常小鼠和CIA小鼠的肺脏HE染色病理图见图7,结果显示:
正常小鼠的肺组织中肺泡的结构完整清晰,肺泡腔和支气管腔非常干净,有少量的红细胞。
CIA小鼠的肺部有大量的炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡腔中有炎性浸出物,部分肺泡变小。
3.3.6肾脏病理学表现
正常小鼠和CIA小鼠的肾脏HE染色病理图见图8,结果显示:
正常小鼠的肾脏结构正常,有皮质和髓质之分,可见大量的泌尿小管,以及由少量结缔组织、血管、神经等构成的肾间质,肾小管上皮细胞完好。
CIA小鼠的肾脏未见明显的病理变化。
3.4小鼠肺组织中TGF-β1和TNF-α的mRNA表达水平
由图9可知,模型组小鼠肺组织中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平明显高于正常组小鼠的肺组织(P<0.01)。
4讨论
类风湿关节炎作为以滑膜炎和关节炎为主要表现的全身性疾病,经常伴有一些关节外损害[9]。
本文采用牛II型胶原混合完全弗氏佐剂诱导DBA/1小鼠,成功建立了小鼠CIA模型,并观察小鼠各个重要脏器的病理变化,以期观察该模型是否存在关节外的并发症。
研究发现,造模成功的DBA/1小鼠除肺部有明显病变外,肝、心、脾、肾未出现明显的病理变化。
据临床观察及文献报道,肺脏是RA患者除关节外最易受累的器官,这与肺内部丰富的结缔组织及血液供应有很大关系。
RA的肺部并发症包括肺间质病变、细支气管炎、慢性支气管扩张、胸腔积液、类风湿结节等[1]。
RA并发的呼吸系统疾病在RA患者死因中位居第二位,且近年来其死亡率呈明显上升趋势,其中由于类风湿关节炎间质性肺病(RA-ILD)引起的肺泡炎性肺纤维化是其死亡的直接或间接原因[10]。
RA-ILD的高死亡率是由于肺部病变早期症状不明显易被忽略,晚期出现症状后预后差[11]。
因此早发现、早诊断、早治疗RA合并肺部并发症有重要意义。
间质性肺病早期肺实质细胞发生急性肺泡炎,炎症和免疫效应细胞不断增生、募集与活化,随着病情发展,肺泡结构破坏,间质胶原紊乱,大量纤维组织增生,肺泡隔被破坏,形成囊性化,病变不可逆[12]。
我们的研究发现CIA小鼠的肺部出现明显的炎性病变,肺间质内有大量的炎细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡腔中有炎性浸出物,这与RA肺部并发症的病理变化有相似之处。
RA-ILD的发病机制可能与细胞、细胞因子
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