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(4)加快珍稀频危动物的繁殖进程。
(5)克服母牛异性孪生不育等
1家畜性别控制的历史回顾
早在公元前400多年,Democritus就设想人为地控制动物性别。
在我国民间有许多人为控制性别的说法。
进入20世纪后,随着科学技术的发展,关于人为控制动物性别逐渐发展成为一门科学。
1902年,Mcclung在研究蝗虫精细胞时,在历史上第一次提出性别决定的染色体理论。
Stenvens和Wilson研究指出,雌、雄个体中不同的性染色体与性别有关,并将性染色体定义为X染色体和Y染色体。
20世纪前半个世纪的大量研究证实,哺乳动物的性别是由一对性染色体所决定的。
在哺乳动物的所有正常配子中均含有一组常染色体和一条性染色体,即雌性卵子所含的性染色体为X染色体,而雄性精子则有两类性染色体,一部分精子含有X染色体,另一部分则含有Y染色体。
携带Y染色体的精子(Y精子)与卵子结合受精,其受精卵就向雄性个体(XY)发育,而携带X染色体的精子(X精子)与卵子结合受精,其受精卵就朝雌性个体(XX)发育[1]
1955年Eichwald和Silmser[2]发现了雄性特异性弱组织相容性抗原(H-Y),引发了对精子分离选择和胚胎性别鉴定的广泛研究。
1959年,Jacabs[1]等认为决定雄性性别的因素存在于Y染色体上,并于1966年证实雄性性别决定基因位于Y染色体短臂上。
20世纪80年代,美国韦赫生物医学研究院发现,Y染色体上的基因启动雄性性别的发育,将该基因称为睾丸决定子(Testis-determiningfactorTDF[3]。
Palmer等(1989)[4]发现,决定动物性别的基因是Y染色体上一个核心区基因,并将其命名为SRY(SexDeterminingRegioninY-Chromosome)。
由于一系列的动物性别决定因素的发现,人们针对性地研究出许多进行性别鉴定的有效方法,为动物性别控制开辟了行之有效的科学方法。
2性别控制的基本方法
目前,性别控制的方法可分为两大类:
一为X与Y精子的分离,二为鉴定胚胎性别。
2.1X与Y精子的分离
2.1.1分离X与Y精子的生物学基础
(1)X精子的F小体:
1968年Cosperson[5]在研究男性染色体时发现,在Y染色体长臂末端发出有比其他部分强的荧光亮点,将这些点称为F小体。
1970年Barlow[6]等首次报道在Y精子头部发现F小体,且F小体在人和家畜的精子上都能见到。
后来经实验反复证明,有F小体的精子一定是Y精子,而没有的则是X精子。
(2)精子的重量:
X与Y精子在重量和比重上有差异,主要表现在DNA量的不同。
Morruzi(1979)[7]报道了X与Y精子染色体所含DNA的不同,X染色体更大,其DNA含量也比Y染色体所含的DNA多,重量更大。
两者的DNA含量差异一般在3%~5%之间,其中牛为3.9%,绒鼠为7.5%(Johnson等,1987b)[8]。
由于重量和比重的不同,而致X和Y精子在液体中运动力、沉降速度等的不同。
(3)精子运动:
据报道,Y精子的活动能力比X精子强,运动速度快,在含血清蛋白的稀释液中呈直线运动。
Ericsson[9]等(1973)将人的精液置于血清白蛋白柱的上层,从柱的最下面分离出的精子与原精液相比,运动的精子的比率高,其83%为F小体阳性,即Y精子。
精子的表面膜电荷:
精子的表面均带有膜电荷,为负电荷,但X、Y精子表面的电荷量和分布有差异。
膜电荷量取决于同核蛋白结合的唾液酸的含量。
Y精子尾部膜电荷较多,而X精子头部膜电荷较多。
(4)精子的耐酸碱性:
Y精子更嗜碱性,而X精子则更嗜酸性。
(5)H-Y抗原及分布:
H-Y抗原即雄性特异性弱组织相容性抗原(MaleSpecificMinorHistocompatibility—YAntigen,简称H-Y抗原),H-Y抗原是一种弱抗原,并且已证实,只有Y精子才能表达H-Y抗原。
2.1.2精子分离的研究方法和现状
由于X、Y精子存在物理化学和生物学上的差异,人们一直试图依据这些微小的差异将X、Y精子分离。
(1)沉降法:
Schilling等(1967)[9]将由脱脂乳、盐类及卵黄组成的液体,调制成黏度为7~10CP、比重1.037~1.044的液体,用于沉降分离牛精子。
沉降时间在60min内,使用最下层的分离液对母牛进行人工受精,结果雌性率为70%。
用上层部分精子配种,雄性犊牛为63.9%。
实验在牛、羊等上的多数结果表明:
用上层精液输精得到的多数为雌性,而下层则多数为雄性,但是各种结果的差异性很大。
沉降法虽然有一定的效果,但试验结果不稳定。
(2)离心沉降法:
Lindahl(1970)[10]在12~20摄氏度环境下离心牛精子,将上下层精子分别给母牛输精,上层产公犊58.7%(27/46),下层产母犊58.72%。
Shastry等[11](1977)用聚蔗糖胶体密度梯度分离出73%的含F小体的精子。
Luderer等(1982)[12]用牛顿凝胶离心分离牛精子输精,得雄性犊牛29头,雌性犊牛25头。
乌兰少布(1985)用生理盐水稀释羊精液并离心,输下层液雌羔率为76%,上层液为21.87%。
玲木达行(1986)[10]用Perool密度梯度分离牛精子,将分出的X精子层给母牛授精所得母犊77.8%。
Ogawa等(1987)[10]用密度梯度离心法分离猪精子,在底层收集到的精子中,有F小体的精子为10.1%。
虽然离心沉降法分离精子的成功率较高,但离心过程对精子破坏性大,常使精子畸形、活力下降。
(3)电泳法:
Shoredon(1932)[13]用电泳法分离牛精子,分别收集向两极运动的精子。
阳极雌性占71.3%,阴极雄性占63.8%。
Hafs和bod(1974[12]将10%卵黄磷酸缓冲液稀释的精液3.5ml置于活动式间隔槽内,以8V/cm和21/cm在35摄氏度下电泳移动1min,用正极处的精子输精得到121头犊牛,55%为雄性;
用负极处的精子输精得到137头犊牛,44%为雄性,但对照组的59头犊牛中也是44%为雄性。
Cardon(1975)[13]电泳兔精液,用阳极精液输精,仔兔中有74.3%为雌性;
阴极精液输精,雌性率仅占15.1%。
刘嗣枢等(1985)[13]用改装电泳装置分离牛的精子,阳极侧X精子占90.38%。
Mobri等(1986)[10]用自由电泳法处理人的精液时发现,在pH7.4时,阳极侧多为X精子,阴极侧多为Y精子(80%);
Engelmannl等[10](1988)用此方法却得到与此完全相反的结果。
(4)免疫学分离法:
该方法是利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原,以此来分离X精子和Y精子。
由于H-Y抗原极弱,因此对细胞表面H-Y抗原进行血清学和免疫学的检测在70年代的效果并不理想。
随着生产高效价H-Y抗体方法的发展,并在Bryant等[12](1980)应用H-Y抗体免疫学亲和柱层析首次成功地分离了人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子后(已经获美国专利),利用H-Y抗原进行动物性别的控制的研究才有实质性进展。
Zavos(1982)[14]用兔子生产抗血清进行实验,把H-Y抗血清注入母兔阴道,15min后输精,产出的雌性兔为74.2%;
1987年他又采用免疫过滤法对兔子和牛进行试验,用抗H-Y的单克隆抗体晕聚精细胞的H-Y复合体,结果后代中雌兔为78.9%、母犊为74.4%。
Bradley(1989)[12]用免疫亲和柱层析法分离绵羊的H-Y阳性和H-Y阴性精子,发现未结合到层析柱的精子有70%~80%为阴性,结合到层析柱上而后被洗脱下来的精子75%~78%为阳性;
而对照组的H-Y阳性和H-Y阴性精子分别为43%~44%和56%~57%。
王光亚等(1994)[15]用兔H-Y抗血清进行试验,将效价为1:
32的兔H-Y抗血清输入发情母兔阴道内10~15min后自然交配,所生2只小兔均为雌兔。
(5)流式细胞分离法(流式细胞光度法):
借助流式细胞光度计进行测定,其理论依据是X与Y精子DNA的含量不同。
DNA含量高,当用专用荧光染料染色时,其吸收的染料就多,发出的荧光也强,反之发出的荧光就弱。
这种分离方法开创了精子分离的新局面。
Johson等[16](1989)用分离的兔Y精子在子宫内输精后,预测雄性兔比例为81%,实际亦为81%;
X精子输精后预测雄兔的比例为14%,实际产雄兔的比例为6%。
1991年他用经使用该法分离的猪X精子输精后,获得74%的雌性仔猪,Y精子输精后获得68%的雄性仔猪。
Gran等[17](1993)使用该法分离牛精子用于体外授精,将胚胎移植给9头受体牛,其中4头妊娠产牛犊6头,3头雌性,3头雄性,均与预测性别相符。
Abeydeera等[18](1998)报道,利用该法分离的猪X精子授精,产雌性23头,雄性1头,准确率为97%;
利用分离的Y精子授精,产雄性仔猪率为100%。
Seidel等[19](1999)报道了使用牛分离精子冷冻保存后的授精效果,后代性别准确率在90%以上。
但是用一般流式细胞分类器分离精子时,需要精子一个个通过,这样就必须稀释精液,造成精子的运动能力下降,加之分离效率太低,目前还无法应用于实际生产。
但是,据Johson(2000)[20]报道,同时分离收集X和Y精子,分离速度以达到每小时6000000精子;
若只分离和收集X精子,则分离速度可达到每小时18000000精子,看来,用于生产实践为期已不远。
如果结合显微注射技术,该方法将是一种有效的分离X、Y精子的技术。
其他方法:
柱层析分离法、化学药品处理法、Y特异性DNA探针法。
在奶牛上人们研究了输精时间与后代性别比例关系,发现排卵前输精易得雌性后代,排卵后输精易得雄性。
2.2胚胎性别鉴定
动物性别控制可以通过对其胚胎进行性别鉴定,然后移植所需要的性别,以达到性别控制的目的。
至今发展较为成熟的方法包括:
细胞学方法、生物化学微量分析法、免疫学方法和分子生物学方法。
2.2.1细胞学方法
该方法是经典的胚胎性别鉴定方法,主要是通过核型分析而对胚胎进行性别鉴定。
鉴别过程是将胚胎用含有丝分裂阻滞剂的培养液培养,然后诱使细胞肿胀及染色体扩展并加以固定、染色、在显微镜下检查其核型,其准确率为100%。
但要获得高质量的中期染色体分散相难度很大,据报道中期分散相的获得率一般在61%~81%之间,而能用于进行核型鉴定的只有6.7%~60%。
这对于胚胎的浪费很大,而且耗时费功。
虽然结合了胚胎分割技术,分割一半胚胎用于鉴定,另一半进行冷冻或者移植,已经获得性别鉴定的犊牛(Seike)[10]。
目前该方法主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。
2.2.2生物化学分析法
该方法是通过测定与X染色体相关的酶活性,来达到鉴别胚胎性别的目的。
其原理是早期雌性胚胎的两条X染色体中有一条失活。
一般在哺乳动物中雌性带有两条X染色体,而雄性则带有一条X染色体和一条Y染色体。
在胚胎发育早期,为保持两性间的基因等量,雌性的一条X染色体失活。
在胚胎基因组的激活和X染色本失活这一短暂期雌性胚胎的两条X染色体都可以被转录和翻译。
这样雌性胚胎的X染色体连锁酶的活性和浓度是雄性胚胎的两倍。
这些相关酶有6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、腺嘌呤磷
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