西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF7ADR细胞的耐药性研究Word下载.docx
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西地那非同系物逆转人乳腺癌MCF7ADR细胞的耐药性研究Word下载.docx
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运用流式细胞术观察分别经西地那非同系物处理前后,人乳腺癌MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123浓度的改变情况,并分析该2种同系物对乳腺癌细胞P-gp蛋白外排功能的影响。
结果MTT结果显示10μmol/L的2种西地那非同系物对MCF-7/ADR细胞耐药性的逆转倍数分别是6.36和5.58;
20μmol/L的2种西地那非同系物对MCF-7/ADR细胞耐药性的逆转倍数分别是11.83和13.47;
流式细胞术结果显示经10、20μmol/L的西地那非同系物处理后的MCF-7/ADR细胞内Rhodamine123浓度明显增强。
结论一定浓度的西地那非同系物可抑制乳腺癌MCF-7/ADR细胞P-gp蛋的外排功能,并显著逆转其对多柔比星的耐药作用。
[关键词]XDNF1-0425;
XDNF8-0113;
多药耐药;
逆转;
乳腺癌细胞[中图分类号]R979.9[文献标志码]A[文章编号]1008-
8199(201403-0245-05基金项目:
广州市国际区域科技合作项目(2011J5200017作者单位:
510006广州,广东药学院研究生院[季
恒(医学硕士研究
生];
510310广州,广东药学院公共卫生学院(葛如意、王德全、梅文杰、黄海波、周俊立、郑士杰、石永超、汪保国、陈思东
通讯作者:
汪保国,
E-mail:
gdwangbaoguo@163.comSildenafilhomologuesreversethedrugresistanceofhumanbreastcancercelllineMCF-7/ADR
JIHeng1,GERu-yi2,WANGDe-quan2,MEIWen-jie2,HUANGHai-bo2,ZHOUJun-li2,ZHENGShi-jie2,
SHIYong-chao2,WANGBao-guo2,CHENSi-dong2(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity,graduateschool,Guangzhou510006,Guangdong,China;
2.Guangdong
PharmaceuticalUniversity,SchoolofPublicHealth,Guangzhou510310,Guangdong,China
[Abstract]ObjectiveMultidrugresistance(MDRofcarcinomaisanimportantcauseofchemotherapyfailureandmortalityincancerpatients.TheaimofthisstudywastoexplorethereversaleffectofXDNF1-0425andXDNF8-0113onDoxorubicin(DOX
resistanceinhumanbreastcancercelllineMCF-7/ADRinvitro.MethodsUsingMTTassay,wedeterminedtheinhibitoryeffectof
sildenafil,XDNF1-0425,XDNF8-0113,DOXandDOX+sildenafilhomologuesonthegrowthofhumanbreastcancercelllinesMCF-7
andMCF-7/ADR,andfiguredouttheinhibitiveconcentration50(IC50.Weusedflowcytometrytodetecttheconcentrationofrhoda-mine123intheMCF-7/ADRcellstreatedwithXDNF1-0425orXDNF8-0113andanalyzeditseffectonP-gp-mediateddrugefflux.
ResultsThesensitivityofMCF-7/ADRtoDOXwassignificantlyincreasedbythetwosildenafilhomologuesXDNF1-0425and
XDNF1-0113inadose-dependentmanner(P<0.05.XDNF1-0425andXDNF1-0113reversedthedrugresistanceofMCF-7/ADR
by6.36and5.58timesat10μmol/Landby11.83and13.47timesat20μmol/L,respectively.Flowcytometryshowedsignificantlyincreasedconcentrationsofrhodamine123intheMCF-7/ADRcellsaftertreatedwiththetwosildenafilhomologuesat10or20μmol/L.
ConclusionSildenafilhomologuesatacertainconcentrationcaninhibitP-gp-mediateddrugeffluxofthehumanbreastcancercellline
MCF-7/ADRandeffectivelyreverseitsresistancetoDoxorubicin.[Keywords]XDNF1-0425;
Mutidrugresistance;
Reverse;
Breastcancer
引言
多药耐药(multidrugresistance,MDR是指肿
瘤细胞长期接触某一化疗物后可产生对此种化疗药物耐药性,而且可对其他结构和作用机制不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。
多柔比星(Doxorubicin是乳腺癌化疗的常用药物,乳腺癌
细胞的对多柔比星产生耐药是多柔比星化疗失败的主要原因[1],也是影响临床肿瘤患者预后的重要因素[2]。
乳腺癌是排名第一的女性常见恶性肿瘤,寻找克服乳腺癌MDR的药物或方法成为当前肿瘤研究的热点[3]。
目前研究发现MDR的有效抑制剂有维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素[4-6]等,但这些耐药逆转剂干扰传统的抗癌药物药代动力学,且由于可引起严重的毒副作用等,至今都未取得预期的临床效果,因此在临床上被限制使用。
寻找低毒高效且与合用的抗肿瘤药物无药动学交互作用的抑制剂,以提高药物的利用度,避免和降低药物的不良反应在指导临床抗肿瘤个体化治疗方面具有重要意义,同时也是当前肿瘤耐药性研究中的重要发展方向。
西地那非(Sildenafil,又译昔多芬,是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发现的治疗男性勃起功能障碍药物。
已有研究发现5型磷酸二酯酶抑制剂西地那非[7]和伐地那非[8]能逆转P-gp蛋白介导的MDR。
同时也有研究发现西地那非和伐地那非可逆转MDR相关蛋白7(MRP7介导的紫杉醇耐药[9]。
本研究所用药物是西地那非的同系物,由本实验室指导广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物,拥有独立的知识产权。
本研究旨在通过观察药物处理后MCF-7/ADR和MCF-7细胞株的生长抑制率、Rhodamine123浓度,探讨西地那非同系物体外实验的安全性极其逆转乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药性的机制。
1材料与方法
1.1细胞株实验所用MCF-7和MCF-7/ADR细胞株由中山大学附属肿瘤医院惠赠;
其中MCF-7/ADR细胞株是通过浓度递增的多柔比星反复间歇诱导获得,对多柔比星耐药,而MCF-7细胞则为敏感细胞株。
1.2药物和器材本研究所用药物是由广东药学院药科学院实验室合成的新型化合物,化学物结构式见图1(自编号XDNF1-0425和XDNF8-0113,其电喷雾质谱(ESI-Ms分别为m/z412.3([M+H]+和m/z331.3([M+H]+;
西地那非单体由圣约翰大学陈哲生教授惠赠;
多柔比星、MTT、Rhodam-inel23均购于美国Sigma公司,DMEM培养基购于美国Hyclone公司,倒置显微镜为日本Nikon公司产品,流式细胞仪为美国BD公司产品。
1.3细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7和MCF-7/ADR于含10%胎牛血清和青霉素(100U/mL、链霉素(100U/mL的DMEM培养液中常规培养(37ħ、5%CO
2
。
实验前在无药培养基中培养2周。
细胞隔日换1次培养液,每隔3、4天传代1次
a:
XDNF1-0425;
b:
c:
西地那非
图1XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非结构图
Figure1StructuralformulasofXDNF1-0425,XDNF8-0113andsildenafil
1.4MTT法检测细胞毒性实验
1.4.1MTT法[10]测定2种西地那非同系物体外实验的安全浓度取对数生长期MCF-7和MCF-7/ADR细胞进行种板(8000细胞/孔,CO
的培养箱培养24h后分别加入不同浓度的XDNF1-0425和XDNF8-0113(1、10、100、1000μmol/L,不加药物的为阴性对照组,只加培养基的为调零组,每组设3个复孔;
继续培养68h后加入10μLMTT(5mg/mL,培养4h后酶标仪(波长570nm检测吸光值(A,并绘制药物浓度与细胞生存率曲线图。
细胞生存率=A
加药组
/A
对照组
ˑ100%
1.4.2MTT法测定2种西地那非同系物对MCF-7/ADR耐药的逆转作用采用上述方法将准备好的MCF-7和MCF-7/ADR细胞分组种板,每组设3个复孔。
24h后加药,共分5组:
①只加培养基的调零组;
②不加药物只加细胞的阴性对照组;
③多柔比星组:
按浓度梯度分别加入多柔比星(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μmol/L,每孔10μL;
④多柔比星+药物组:
XDNF1-0425和XDNF8-0113分别以无毒剂量(2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L与多柔比星共同加入;
⑤多柔比星+西地那非组:
不同浓度的西地那非(2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L与多柔比星共同加入。
CO2的培养箱继续培养68h后常规MTT比色法测定和记录各孔A值,并计算抑制率、半抑制率(IC50以及逆转倍数。
IC50通过线性回归分析计算,细胞抑制率和逆转倍数公式计算如下:
细胞抑制率(%=(1-实验孔A值/对照孔A
值ˑ100%
逆转倍数=耐药细胞IC50/药物干预下IC501.5细胞内Rhodamine123累积实验取对数生长期MCF-7和MCF-7/AD
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