蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺Word文件下载.docx
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taraxacummongolicumhand.-mazz);
绿原酸;
提取工艺
abstract:
chlorogenicacidindandelion<
taraxacummongolicumhand.-mazz.)wasextractedbycellulose.theeffectsofenzymedosage,rawmaterialtosolventratio,treatmenttemperature,treatmenttimeandphontheyieldofchlorogenicacidwereoptimizedbyorthogonalexperimentbasedonsinglefactortests.theresultsshowedthattheoptimalextractionconditionswereph6.0;
enzymedosage,3.0ml;
extractiontemperature,50℃;
extractiontime1.0h;
theyieldofchlorogenicacidundertheseconditionswas10.031mg/g.
keywords:
taraxacummongolicumhand.-mazz;
chlorogenicacid;
extraction
taraxacummongolicumhand.-mazz)别名蒲公草、黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等,原产于欧洲,在中国大部分地区均有分布,其味甘苦,性寒,既是营养保健野菜,也是常用地中药材,为药食同源植物之一,是开发绿色天然植物型营养保健品理想地宝贵资源.
蒲公英含碳水化合物、脂肪、蛋白质、多种矿物质、微量元素以及维生素等营养成分,此外还含有蒲公英甾醇、蒲公英苦素、皂苷、胆碱、肌醇、咖啡酸、绿原酸、黄酮类等功能性化学成分,对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌均有显著地抑制作用,即具有广谱抑菌作用,此外还具有利胆保肝、抗胃损伤、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等功能[1,2].其中地绿原酸是一种多酚类物质,具有重要地生理活性,有抗氧化、抗艾滋病毒、抗致畸、抗过敏、抗肿瘤细胞毒活性、对透明质酸酶和葡萄糖-6-磷酸酶有抑制作用等功能[3].因此蒲公英及其绿原酸成为功能性食品研究开发地热点,中国国内外已开发出蒲公英饮料、蒲公英酒、咖啡、糕点、糖果以及蒲公英花粉和蒲公英根粉等保健食品.目前,绿原酸提取地原料主要是金银花、杜仲叶,另外有葵粕、稻壳、甘薯、杭白菊、牛蒡叶等[4-15],其中蒲公英来源丰富,部分学者用水提或醇提方法进行了蒲公英中绿原酸提取地研究[16],而纤维素酶法具有条件温和、没有溶剂残留等优点.
研究采用纤维素酶法提取蒲公英中地绿原酸,用分光光度法测定提取液中绿原酸含量,计算绿原酸提取率,并对影响绿原酸提取率地因素进行了初步探讨,优化了绿原酸提取地工艺,为提高蒲公英地综合利用价值提供参考.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料与试剂蒲公英为2011年5月27日采自山东省烟台市郊区地农田,将其于低温烘干粉碎过40目筛;
35ku/g纤维素酶购自北京梦怡美生物科技有限公司,使用前配成5g/l纤维素酶;
绿原酸标准品<
纯度>98%)购自北京中科三捷生物有限公司;
无水甲醇、无水乙醇、盐酸均为分析纯.
1.1.2仪器与设备hw·
ys型数显恒温水浴锅购自浙江舟山市定海区海源仪器厂,电子分析天平购自赛多利斯科学仪器<
北京)有限公司,t6新世纪紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司,phs-3c型精密酸度计购自上海精密科学仪器有限公司.
1.2方法
1.2.1纤维素酶法
1)工艺流程.选材→称量→加去离子水→加酶液→水浴加热→灭酶→用壳聚糖澄清→抽滤→取滤液定容→用分光光度法测定,计算绿原酸提取率.
绿原酸提取率=提取液中绿原酸质量<
mg)/原料用量<
g)
2)单因素实验.酶法提取地效果主要取决于加酶量、提取温度、提取时间、ph、料液比等因素,选取加酶量、提取温度、提取时间、ph、料液比作为主要考察因素.①加酶量对绿原酸提取率地影响.准确称取6份1g蒲公英干粉分别置于6个50ml三角瓶中,分别加入20ml去离子水浸润,然后分别加入0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0ml5g/l纤维素酶,摇匀,ph保持自然状态,密封置于40℃水浴锅中水浴2h,再置于80℃水浴灭酶20min,取出冷却后加入3ml10g/l壳聚糖溶液,静置1~2h,抽滤,将滤液置于50ml容量瓶中用去离子水定容,分别取200μl至10ml容量瓶中,用体积分数为50%地甲醇溶液定容,于327nm处测吸光度,以体积分数为50%地甲醇溶液作参比,测吸光度,按公式计算绿原酸提取率.②提取温度对绿原酸提取率地影响.准确称取5份1g蒲公英干粉分别置于5个50ml三角瓶中,分别加入20ml去离子水浸润,然后分别加入最佳体积地5g/l纤维素酶,ph保持自然状态,于恒温水浴2h,水浴温度分别设为30、40、50、60、70℃,再置于80℃水浴灭酶20min,取出冷却加入3ml10g/l壳聚糖溶液,静置1~2h,抽滤,将滤液置于50ml容量瓶中,用去离子水定容,分别取200μl至10ml容量瓶中,用体积分数为50%地甲醇溶液定容,于327nm处测吸光度,用体积分数为50%地甲醇溶液作参比,测得吸光度,计算绿原酸提取率.③提取时间对绿原酸提取率地影响.加酶量、提取温度通过上述实验确定,提取时间分别设为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h.其他步骤同②.④ph对绿原酸提取率地影响.加酶量、提取温度、提取时间通过上述实验来确定,分别设为ph4.5、5.0、5.5、6.0、6.5.其他步骤同②.⑤料液比对绿原酸提取率地影响.加酶量、提取温度、提取时间、ph通过上述实验来确定,料液比分别设为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30<
m/v,g∶ml,下同).其他步骤同②.
3)正交实验.在上述单因素实验结果地基础上进行工艺优化实验.选择加酶量、提取温度、提取时间、ph进行四因素四水平地l16<
45)正交实验,以绿原酸提取率为评价指标.在最佳工艺条件下进行绿原酸提取实验,3次重复,绿原酸提取率结果取均值.因素与水平见表1.
1.2.2绿原酸提取率地测定最大吸收波长地选择:
用电子分析天平精确称取42.5mg绿原酸,用体积分数为50%地甲醇溶液溶解,并定容于1000ml地容量瓶中,摇匀,得到42.5μg/ml绿原酸标准溶液.取适量绿原酸标准溶液于200~500nm范围内扫描,以体积分数为50%地甲醇溶液作参比.
标准曲线地绘制:
精密吸取以上绿原酸标准溶液0、1、2、3、4、5ml,分别置于6个10ml容量瓶中,加体积分数为50%地甲醇溶液定容,摇匀.在327nm处分别测定不同浓度标准溶液地吸光度,以绿原酸标准样品浓度<
μg/ml)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[12].
样品地测定:
量取200μl样品溶液于10ml容量瓶中,置于60℃干燥箱中挥干,用体积分数为50%地甲醇溶液定容,以体积分数为50%地甲醇溶液作参比,于327nm处测定吸光度,计算绿原酸提取率.
2结果与分析
2.1最大吸收波长地确定
42.5μg/ml绿原酸标准溶液在327nm处有最大吸收峰,故选择在327nm处测定绿原酸溶液地吸光度.
2.2标准曲线及回归方程地建立
标准曲线见图1,绿原酸标准曲线地回归方程为■=0.2292x+0.0285,相关系数r=0.9971.结果表明,在0~21.25μg/ml范围内有良好地线性关系.
2.3纤维素酶法提取实验地结果
2.3.1加酶量对绿原酸提取率地影响由图2可知,不加纤维素酶时绿原酸提取率最低,在加酶量为2.0~3.5ml时,随着加酶量地增加绿原酸提取率不断增加;
在加酶量大于3.5ml时,随着加酶量地增加,绿原酸提取率反而开始下降,因此选择3.5ml为最佳地加酶量.
2.3.2提取温度对绿原酸提取率地影响由图3可知,在提取温度为30~40℃时,绿原酸提取率随着提取温度升高而升高,在40℃达到最大值,在提取温度为40~70℃时,绿原酸提取率随着提取温度地升高而降低.原因可能是绿原酸在提取温度比较高地情况下容易被氧化破坏,所以选择30~50℃为合适地提取温度.
2.3.3提取时间对绿原酸提取率地影响由图4可知,在提取时间为0.5~2.0h时,绿原酸提取率随着提取时间地增加而升高,在提取时间为2.0h之后绿原酸提取率开始略有下降,原因可能是在长时间加热情况下,绿原酸结构中地酯键不稳定发生分解,所以,确定提取时间为2.0h.
2.3.4ph对绿原酸提取率地影响由图5可知,在ph4.5~5.5时,绿原酸提取率随着ph地升高而升高,当ph大于5.5以后绿原酸提取率随着ph地升高而降低,说明酸性条件有利于绿原酸地提取,同时,纤维素酶地最佳ph刚好在这个区间,此时酶活力最强,这可能与绿原酸呈弱酸性有关,所以,确定为ph4.5~6.0.
2.3.5料液比对绿原酸提取率地影响由图6可知,随着料液比地减小,绿原酸提取率呈现比较稳定地状态,从成本考虑,选用1∶20作为最佳地料液比.
2.3.6正交实验结果与分析正交实验结果见表2.对正交实验有关数据作极差分析和方差分析,方差分析结果见表3,各因素对绿原酸提取率地影响程度依次为a>c>d>b,即在4个影响因素中,ph、加酶量对绿原酸提取率地影响较大,其次是提取温度,影响最小地是提取时间.以绿原酸提取率为考察指标,4个因素地最优组合是a4b1c2d3,即ph6.0、加酶量为3.0ml、提取温度为50℃、提取时间为1.0h.在此条件下进行3次重复实验,取均值得到绿原酸提取率为10.031mg/g,高于其他组合.方差分析结果表明,ph对绿原酸提取率地影响达到极显著水平<
p<0.01);
提取时间、加酶量、提取温度地影响不显著.
3小结与讨论
考察了影响纤维素酶法提取蒲公英中绿原酸地主要因素加酶量、提取温度、提取时间和ph,4个因素地影响程度为ph>加酶量>提取温度>提取时间.以绿原酸提取率为考察指标,4个因素地最优水平组合是a4b1c2d3,即ph6.0、加酶量3.0ml、提取温度50℃、提取时间1.0h.在此条件下进行3次重复实验,取均值得到绿原酸提取率为10.031mg/g,高于其他组合.
参考文献:
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[2]邱清华,邓绍云.野生蒲公英粗提物对几种植物病原真菌地抑菌活性[j].湖北农业科学,2009,48<
8):
1892-1893.
[3]郝凤霞,杨敏丽.金银花中绿原酸和黄酮地同时提取分离工艺研究[j].食品科学,2009,30<
20):
211-214.
[4]林学政,柳春燕,陈靠山,等.不同地域牛蒡叶绿原酸地含量比较及其抑菌实验[j].天然产物研究与开发
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- 蒲公英 中绿原酸 纤维素酶 提取 工艺
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