第二学期实验内容与步骤Word文档格式.docx
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2、无菌操作中的灭菌和消毒
(1)无菌技术:
①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒;
②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌;
③为避免周围微生物污染,实验操作应在酒精灯火焰旁进行;
④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
(2)消毒方法:
①日常生活经常用到的是煮沸消毒法;
②对一些不耐高温的液体,则使用巴氏消毒法;
③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果,然后使用紫外线进行物理消毒;
④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。
(3)灭菌方法:
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法;
②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法,所用器械是高压蒸汽灭菌锅;
③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法,所用器械是紫外灯。
(4)比较消毒和灭菌:
比较项
理化因素的作用强度
消灭微生物的数量
芽孢和孢子能否被消灭
消毒
较为温和
部分生活状态的微生物
不能
灭菌
强烈
全部微生物
能
(5)注意事项:
①实验中用的棉花不能用脱脂棉,因脱脂棉易吸水,吸水后容易造成污染。
灭菌后,通常在60~80℃烘箱中除去灭菌时的水分;
②物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后,要首先打开排气阀,煮沸并排除锅内冷空气,其目的是有利于锅内温度升高,随后关闭排气阀继续加热,加热结束切断热源后,要使温度自然降低,气压务必降至零时打开锅盖,其目的是防止容器中的液体暴沸;
③在用任何器皿转接时,瓶塞和封口膜只能夹在手上,不许放在台面上,接种时要在酒精灯火焰旁操作;
④培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上,否则容易污染;
⑤接种时要胆大心细,动作快捷,这是减少污染的关键;
⑥接种后,培养皿必须倒放(盖在下方)在恒温培养箱中,如正放则水蒸气在盖上凝成水滴,滴到接种后的培养基表面,水流扩散会使菌落扩散,就很难形成单菌落了
3、试剂配制
(1)LB培养液
10gTryptone(蛋白胨),5gYeastExtract(酵母浸粉),10gNaCl(氯化钠),双蒸水定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存。
(按需配制)
(2)LB平板培养基
在LB液体培养基中加入琼脂粉10,高压灭菌,冷却至45℃左右时倒平皿,4℃保存。
(每个平板需要20-25ml培养液)
(3)LA平板培养基(LB带有氨苄抗性的平板培养基)
待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp(100μg/mL),摇匀后倒平皿,4℃保存。
4、菌体的接种
(1)从固体培养基中挑取单菌落。
在挑取单菌落前,需要将接菌环放置于酒精灯上灼烧,用以灭菌,待接种环冷却后,选取大小适中,形状规则的单菌落挑取。
将接菌环插入加有氨苄抗性的液体培养基中,然后取出接菌环在酒精灯火焰上灼烧灭菌,准备接种下一个菌体样品。
(2)接种后的液体培养基三角瓶在酒精灯处烧下,灭菌并封住瓶口放置于恒温振荡培养箱中,37℃,100rpm/min,培养12h或过夜。
(3)将过夜培养后的菌液,将蘸有菌液的接种环在准备好的固体培养基平板划板。
划好平板后放置于37℃培养箱中倒置培养12小时或过夜(主要防止培养过程中产生的水珠滴至培养基上,引起杂菌的滋生)。
5、菌种的保存
(1)菌种保存前准备。
准备50%甘油放置于干净的瓶中灭菌待用。
准备1.5mlEP管并同时灭菌备用。
(2)将液体培养基过夜培养的菌体,按照1:
100倍加入含有抗生素的新培养基中放置进行培养,大约培养2-3个小时,OD约为0.4-0.6(将培养瓶放置于手掌处,看不到掌纹即可)。
(3)将灭过菌的EP管准备好,将新活化的菌体按照体积比1:
1与灭菌过的甘油混合。
最后用封口膜封口,放置于-80℃冰箱中备用。
[注意事项]
(1)注意所有培养基在使用前均需要灭菌处理。
(2)高压灭菌锅要在教师指导下使用。
(3)装液体的试剂瓶需要灭菌时不能超过总容量的三分之一,以免沸腾溅出,注意通气。
(4)酒精灯的使用要在教师指导下进行操作。
(5)无菌操作台的使用需要在教师指导下进行操作。
(6)注意紫外线对人体有灼伤,使用前一定要注意个人保护。
实验二《碱裂解法抽提质粒DNA》
[实验原理]
质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA,大小在1-200kb之间,能在宿主菌中自主复制。
宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同,一种是低拷贝数的,每个细胞仅含有一个或几个质粒分子,称为“严紧型”复制的质粒,另一类高拷贝的质粒,拷贝数可达到20个以上,这种类型称为“松弛型”复制的质粒。
质粒能编码一些遗传性状,如抗药性(氨苄青霉素、四环素等抗性),利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。
质粒作为基因工程载体必须具备以下条件
(1)复制子(ori):
一段具有特殊结构的DNA序列;
(2)有一个或多个便于检测的遗传表型,如抗药性、显色表型反应等;
(3)有一个或几个限制性内切酶位点,便于外源基因片段的插入;
(4)适当的拷贝数。
制备质粒载体是分子生物学的常规技术。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;
蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用。
1、
掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。
2、
掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。
1、试剂配制
10gTryptone,5gYeastExtract,10gNaCl,双蒸水定容至1000mL,高压灭菌后4℃保存。
在LB液体培养基中加入琼脂粉15g,高压灭菌,冷却至45℃左右时倒平皿,4℃保存。
(3)LA平板培养基
(4)溶液I:
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),配制200ml。
取葡萄糖(C6H12O6.H2O)1.982g,双蒸去离子水160ml,0.5mol/LEDTA4ml,1mol/LTris-HCl(pH8.0)5ml,定容至200ml,高压灭菌后4℃保存。
(5)溶液II:
0.2mol/LNaOH,1%SDS。
配制100ml,现用现配。
10mol/LNaOH2ml,双蒸去离子水80ml,10%SDS10ml,最后用双蒸去离子水定容至100ml,室温保存。
(6)溶液III:
配制100ml。
5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,双蒸去离子水28.5ml。
(7)5mol/L乙酸钾(200ml)
乙酸钾98.14g,溶解于160ml双蒸去离子水中,搅拌溶解后定容至200ml。
(8)3mol/L乙酸钠(NaAc)(pH5.2)
取乙酸钠(CH3COONa.3H2O)204.1g,溶解于200ml双蒸去离子水中,用冰乙酸调pH5.2,双蒸去离子水定容至500ml,高压灭菌后4℃保存。
(9)10mol/LNaOH溶液(100ml)
NaOH晶体40g,加水至100ml。
(10)10%SDS
称取SDS10g,溶解于80ml水中,68℃助溶,加数滴1mol/LHCl调pH7.2,定容至100ml。
(11)0.5mol/LEDTA(pH8.0)(100ml)。
Na2EDTA.2H2O18.61g,H2O70ml,边搅拌边加入NaOH固体调节pH,接近pH8.0时才充分溶解,大约需NaOH2g。
最后加水至100ml。
(12)TE缓冲液(pH8.0)(100ml)
10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。
2、细菌的培养
(1)配制LB液体,在琼脂糖平板培养基上划线培养出单菌落(37℃,16-20小时)。
(2)在灭菌过的10ml玻璃培养管中加入3mlLA液体培养基、以及3微升Amp(100ug/ml),挑取单菌落至培养基中。
将培养管置于摇床中,37℃振摇过夜(200-250rpm,16-18小时)。
3、质粒的提取
(1)吸取1.5毫升菌液至1.5mlEppendorf离心管中,3000rpm离心3分钟,弃上清液。
(2)加上1.5毫升菌液,重复操作(1)。
(3)用移液器尽可能除去上清液,加入150微升溶液I,用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
(4)加入250微升溶液Ⅱ,缓慢地上下翻转离心管约10次,混合均匀。
室温下放置5分钟。
(5)加入200微升溶液Ⅲ,上下翻转离心管约10次,混合均匀,冰浴10分钟。
4℃,14,000rpm离心5分钟。
(6)用移液器将上清液转移到新的1.5mlEppendorf离心管中,加入1倍体积酚/氯仿抽提,14000rpm离心5分钟。
(7)重复步骤(6)1次。
(8)移取上清液(400-500微升),加入2倍体积无水乙醇、0.1倍体积3mol/L醋酸钠,置于-20℃冰箱30分钟。
(9)14000rpm离心10分钟,尽量去掉酒精。
(10)用0.5ml70%酒精洗DNA沉淀1次,离心2分钟,尽量去掉酒精,风干10分钟。
(11)加50微升TE缓冲液溶解DNA沉淀,然后加入1微升RNase,37℃过夜,-20℃保存。
4、DNA浓度测定
(1)标准曲线的制作
分别用蒸馏水将DNA标准品配制成浓度为5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg/mL的DNA溶液,于260nm处测定光吸收值,在电脑中用软件制作标准曲线。
(2)样品测定
取20微升质粒DNA置一干净的离心管中,加入2980微升蒸馏水稀释。
然后用紫外分光光度计测定260nm和280nm的光吸收值。
计算DNA浓度,并通过OD260/OD280比值评估样品纯度。
实验三《质粒DNA琼脂糖凝胶电泳》
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100b
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