天然抗肿瘤药物筛选方法的研究进展Word文档格式.docx

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1.细胞水平筛选抗肿瘤药物

采用针对疾病的筛选方法，选取代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株，以培养细胞为实验模型，检测天然药物及其提取物或单体的体外抗肿瘤作用。

体外实验作为初筛，关键在于测定肿瘤细胞的活力，最常用也是比较快的两种方法是：

第一种代谢测定法，细胞还原MTT或XTT产生一种衍生物，其颜色强度与活细胞数成正比，且可用自动分光光度计连续记数；

第二种方法是应用蛋白染料sulforhodamineB，颜色强度也与活细胞数成正比[4]。

细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、耗时短、成本低和大规模筛选等优点，但容易出现假阳性结果，并且不能判断药物的组织特异性[5]。

2.基于肿瘤的产生机理筛选抗肿瘤药物

肿瘤（癌症）并不是一种疾病，而是临床病理表现不同、预后各不相同的多种疾病的组合，其病因及发病机制极为复杂，肿瘤的发生是一个多因素、多基因突变、多步骤、长时间逐渐演化的过程[6]。

现代肿瘤分子生物学的发展使肿瘤发病机理正在逐步阐明，针对机理的抗肿瘤活性成分筛选趋势已形成。

2.1诱导细胞凋亡

细胞凋亡是细胞在一定生理和病理条件下，由基因调控的主动有序的自我消亡过程。

肿瘤与细胞凋亡具有非常密切的关系。

细胞在各种因素作用下，以“凋亡”的形式清除老化的或已受损的细胞时，由于某种因素抑制或破坏了细胞凋亡机制，致使细胞凋亡发生障碍，继而导致细胞继续生存和不断生长，最终演变为肿瘤。

许多天然产物就是通过一种或者几种不同机制来干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终触发肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的[7]。

2.1.1阻滞肿瘤细胞增殖周期诱导凋亡

细胞周期分为G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（有丝分裂期）。

此外细胞在完成分裂后有一个G0期（相对静止期），此期决定细胞是再进入G1期继续分裂还是不再分裂而保持静息或进行分化[8]。

细胞周期调控的异常是肿瘤产生的一种内因。

细胞周期的进展需要大量的胞内外信号的配合，如果缺少适当的信号，细胞将不能从一个阶段转向下一个阶段，这个点称为检定点，这种现象称为周期阻滞，其可诱导细胞发生凋亡[9]。

传统中药苦参的主要成分苦参碱

（1）具有抗炎、抗病毒、抗纤维化等多种药理作用，近年研究发现苦参碱还具有抗肿瘤作用，其对人肝癌细胞BEL-7402，IC50为1g/L。

金艳书[10]等发现，苦参碱可将人肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期，诱导人肝癌细胞发生凋亡，从而发挥其抗肝癌作用。

从金丝马尾连提取的生物碱碱甲hemanzine

（2）在体外对各种癌细胞有明显的抑制作用，其IC50在0.5-1μg/L之间，可阻断G1期细胞向S期过渡,其杀细胞作用有细胞周期特异性。

槲皮素（3）近年来也被发现具有细胞周期抑制作用。

刘丽娟[11]等发现槲皮素能抑制白血病肿瘤细胞HL-60的生长，IC50为10mmol/L。

它能将细胞周期阻断在G2/M期，并且这种阻断作用可以随着从培养基中移去槲皮素而发生逆转。

崔燎[12]等人从凤尾蕨科植物半边旗（Pterissemipinnata）中得到新化合物F-A（4），用其对HL-60和K562细胞作用24h后，对两细胞株的IC50值分别为7.6mg/L和9.1mg/L，进一步研究发现该化合物有G2/M期阻滞作用。

（1）

（2）

（3）

（4）

2.1.2抑制拓扑异构酶的活性

DNA拓扑异构酶是一种调节DNA空间构型的重要核酶，与DNA的复制、转录、重组等密切相关，根据其断裂DNA单、双链的不同，又分为TOPOⅠ和Ⅱ。

由于DNA的超螺旋程度影响着机体的活动，而拓扑异构酶的作用正是调控DNA的空间构型，于是DNA拓扑异构酶顺理成章的成为抗肿瘤药物作用的重要靶点[13]。

研究表明，许多天然产物正是以拓扑异构酶为作用靶点，通过影响拓扑酶的活性，干扰DNA复制及基因的表达进而发挥抗肿瘤作用。

Itoh[14]等对从印度萝芙木（RauwolfiaserpentinaBenth）中分离得到的27个化合物进行了TopoⅠ和Ⅱ抑制活性研究，测试结果显示，化合物（5）具有明显的TopoⅠ和Ⅱ抑制活性，并且对人白血病细胞株HL-60也具有较强的抑制作用，IC50为67μmol/L。

Clericuzio[15]等对Leucopaxillusgentianeus的提取物进行TopoⅠ抑制活性测试，研究发现7个类似葫芦素的化合物均有活性，这些葫芦素类似物具有很强的活性，其中化合物（6）对NCI-H460肿瘤细胞的活性更是达到了0.011mg/L与拓扑替康（topotecan）相当。

从Amphimedon海绵中分离得到的pyridoacridine类化合物（7）具有抑制TopoⅠ和Ⅱ的活性，并可以选择性稳定DNA-拓扑异构酶Ⅰ可裂解复合物。

在体外该化合物对多种肿瘤细胞株生长有明显抑制作用，其中对黑色素瘤细胞株SK-mel-5的活性最强，IC50为130nmol/L[16]。

有文献报道，从云南省真菌-地花菌（Albatrellusconfluens）中提取分离到的Albaconol（8）对多种肿瘤细胞生长的平均IC50值在1.04~2.42μg/ml之间，且能明显抑制小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180的生长。

刘明华[13]等后来研究发现Albaconol的细胞毒活性与其抑制TOPOⅡ的活性有关。

（5）

（6）

（7）

（8）

2.1.3抑制端粒酶活性

端粒酶是位于细胞核内的一种逆转录酶，由hTR（端粒酶RNA）、hTP1（端粒酶相关蛋白1）和hTERT（端粒酶逆转录酶）三部分构成[17]。

端粒酶在肿瘤发生、发展过程中起重要作用，因为它能阻止端粒随细胞分裂而缩短，使细胞绕过衰老而成为永生化细胞，导致人类肿瘤的发生。

由此端粒酶成为开发新的抗肿瘤药的一个具有吸引力的靶点。

从土壤放线菌中分离出来的雷帕霉素（9）具有很强的免疫抑制作用，细胞毒试验结果显示雷帕霉素抗宫颈癌细胞的IC50<

50nM。

VictoriaL[18]等研究发现雷帕霉素能通过抑制hTERT的mRNA转录和阻滞G1细胞循环这两种途径来抑制肿瘤的生长。

一直以来作为拓扑异构酶Ⅰ抑制剂的化疗药喜树碱（10），被发现对HaCaT细胞端粒酶活性的抑制作用先于细胞凋亡的发生，由此表明，喜树碱抗肿瘤作用机制还与抑制端粒酶活性有关[19]。

谢冰芬[20]等对来自天然产物的茶多酚进行了较为深入地研究，结果显示茶多酚对体外培养的人肺腺癌A549，IC50为35.76μg/ml。

其重要成分EGC（11）的抗肿瘤作用就是以端粒酶为靶点，抑制hTERT的mRNA表达。

我国中草药冬虫夏草（cordycepssinensis）的有效成分虫草素（12），有直接抗肿瘤功能，对Hep-G2等多种癌细胞有明显的抑制作用，一直以来作为DNA延长链的终止剂。

随着研究的深入，后有文献报道虫草素也可导致肝癌细胞端粒酶活性下降，抑制抗凋亡基因的激活，促进细胞凋亡[21]。

（9）

（10）

（11）

（12）

2.1.4抑制微管蛋白活性

几乎所有真核细胞的胞质中都有微管存在，它的组合和解体对于细胞的正常生理活动尤其是细胞分裂相当重要，对于这些过程的些许影响都将直接导致细胞分裂失常甚至是细胞凋亡。

由于肿瘤细胞比正常细胞分裂更快更频繁，因此其对药物作用于微管所带来的影响尤为敏感，这使得微管成为抗肿瘤药物作用的有效靶点之一[22]。

天然产物作用于微管有两种方式：

促进微管聚合，抑制微管解聚，从而抑制细胞分裂；

或是抑制微管聚合，使纺锤体不能形成，从而使细胞分裂停止在有丝分裂中期[23]。

自上个世纪90年代以来，来自天然产物的微管蛋白抑制剂引起了研究者的广泛兴趣，其中具有里程碑意义的是紫杉醇（Paclitaxel,Taxol）的发现。

紫杉醇（13）是从短叶紫杉中被发现并分离的，属于二萜类化合物，具有很强的抑制肿瘤细胞活性，IC50小于10nmol/L（耐药细胞株系除外），研究表明紫杉醇可体外诱导微管蛋白在低温、不含GTP或MAPs条件下形成超稳定的微管结构，对Ca2+和低温的解聚作用有一定的抗性，因而有抗肿瘤增殖作用，目前已经作为抗肿瘤药应用于临床[24]。

从纤维堆囊粘菌Sorangiumcellulosum中分离出的大环内酯类化合物epothilonesA和B（14）有和紫杉醇类似的活性，能促进微管蛋白聚合并稳定微管，以非常低的浓度抑制肿瘤细胞的生长，对MDR细胞株CCRF-CEM/VBL100的IC50分别为0.02和0.002mmol/L。

从箭根薯TaccaplantagineaAndr1中发现的甾体类化合物taccalonolideA（15），能抑制人卵巢癌细胞株SK-OV-3扩散，IC50为2.59μmol/L，是能使微管增厚并形成异常的有丝分裂纺锤体的微管稳定剂[25]。

从南非海域海绵Hemias-terellaminor中分离得到的hemiasterlinA.B（16）是细胞生长强效抑制剂，其人工合成类似物HYI2286对18种肿瘤细胞的平均IC50为0.1~2.1nmol/L，具有较好的抗肿瘤活性。

hemiasterlin的抗肿瘤机理与其诱导环状微管聚集物的形成、去极化以及微管不稳定有关[26]。

（13）

（14）

（15）

（16）

2.1.5抑制癌细胞DNA与RNA合成

DNA和RNA是细胞繁殖和遗传的物质基础，起着遗传信息贮存、自我复制和控制蛋白质合成的重要作用[27]。

由于DNA和RNA是肿瘤细胞增殖的物质基础，所以它们可以作为抗肿瘤药物对肿瘤细胞的一个重要作用靶点，在常用的抗癌药中，有许多是通过嵌入DNA改变DNA的性质或者直接抑制DNA与RNA合成，抑制肿瘤生长。

从药用植物重楼中分离提取到的重楼皂苷，在体外实验中，对艾氏腹水癌（EAC）、宫颈癌U14、RS615、肝癌腹水型Hep、小鼠肉瘤S180、小鼠肝癌H22等细胞株有明显抑制作用，其主要的药理作用为抑制DNA合成而发挥抗肿瘤作用[28]。

紫草具有抗肿瘤作用，艾郁葱[29]等发现其醇提物（LE）也有此作用，其对人肝癌细胞株SMMC-7721的IC50为1~2.5μg/ml。

LE通过抑制DNA合成诱导肝癌细胞凋亡，并且LE的增殖抑制作用具有肿瘤细胞的选择性。

来自加勒比被囊动物Ecteinascidiaturbinata中的四氢异喹啉生物碱ecteinascidins743（17），在体外和动物体内实验均显示出强的细胞毒和抗肿瘤活性，其中对L1210细胞的IC50为0.5ng/ml，其抗肿瘤作用机理同样也是抑制DNA合成[30]。

2.1.6作用信号传