油田 注水细菌试剂方法及对照表文档格式.docx
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b生物试剂:
牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母粉等。
c维生素:
烟酸、核黄素、叶酸、VB12、盐酸吡哆醇、D-泛酸钙、生物素、硫胺素等。
d材料:
纱布、脱脂棉、牛皮纸、线绳、6号针头等。
6.仪器和设备
a电热恒温培养箱:
使用温度30~60℃±
1℃;
b电热鼓风干燥箱:
使用温度30~300℃±
5℃;
c高压灭菌锅;
d托盘天平:
最大称量100g,感量0.1g;
e冰箱;
f酸度计:
刻度为0.1ph单位;
g电炉:
1000~2000W;
h烧杯:
100,500,1000ml;
i三角瓶:
500,1000ml;
j量筒:
250,500ml;
k试管:
150mm×
15mm若干个;
l移液管:
1ml;
m酒精灯;
n注射器:
o细口瓶:
125ml;
p显微镜
q水浴
r吸管:
1mL,10mL。
s试管。
t平皿。
u接种环或接种针
w厌氧培养装置
x腐生菌测试瓶、烃氧化菌测试瓶、厌氧发酵菌测试瓶、硫酸盐还原菌测试瓶、产甲烷菌测试瓶。
7.采样
采集的水样应具有代表性。
取样前,取样容器必须灭菌,推荐使用湿热灭菌。
取样前的准备:
取样人穿戴好工作服、手套、防护眼镜,带上酒精棉球、棉纱、卫生纸、记录本和记号笔等。
与油井管理人员联系,取得许可后进入井区。
油水井检查:
观查井生产情况,检查管道和各阀门的工作状态,需要倒工作流程的,应要求当班工人倒流程。
对于掺水生产井,先关闭掺水阀门,正常生产5分钟后再取样;
对于含气量高的井,必须先进行放气处理,放气前要打开气体报警器,同时打开窗户,使空气流通。
取样:
在正常生产的情况下,在井口或集输小站分离器前的取样口进行取样。
取样时,将取样阀打开,使水以5~61/min的流速畅流3min后,再用水样洗涮容器三遍,然后接取样品。
样品装满后立刻加塞塞紧,盖上盖子,随即帖上标签,注明取样日期、时间、地点、取样条件及取样人、样品数等,并将相关信息同时记录在取样记录本上面。
同一样品最好取2-3个,以便进行对比和平行样分析,也便于进行水化学的分析。
清洁现场:
取样结束后,要对取样现场进行清洁处理,经油井管理人员验收合格后离开现场。
样品保藏和运输:
运输过程中避免曝晒或霜冻。
如取样现场距离分析检测地较远,应将样品在低温保藏箱中保藏。
建议取样后尽快进行分析,如不能立即分析,样品取回后保存于6℃冰箱中,从取样到检测样品最好不超过24小时。
8.样品的预处理
对含砂、泥等杂质样品分析前应静置;
含油样品分析烃氧化菌时,应用无菌棉过滤除油;
分析严格厌氧的产甲烷菌时,样品应在无氧条件下取样。
9.分析步骤
在六类菌的分析中,推荐次序为先厌氧后耗氧。
通常按“产甲烷菌MPB-硫酸盐还原菌SRB-厌氧发酵菌FMB-烃氧化菌HOB-腐生菌TGB-硝酸盐还原菌NRB”的次序。
分析过程中推荐使用油藏平均温度和35℃两个温度,35℃的数据便于不同油藏温度区块的对比。
9.1商品液体测试瓶法
部分培养基有商品测试瓶出售,如北京华兴化学试剂厂生产的硫酸盐还原菌、腐生菌等,可用此方法分析。
9.1.1估计水样中细菌的量,将数个装有相应菌类培养基的测试瓶排成一组并依次编上序号。
9.1.2用75%的酒精溶液消毒操作者的手及测试瓶顶盖。
9.1.3用无菌注射器吸取1ml水样注入到1号瓶内,摇匀。
9.1.4另取一只无菌注射器,从1号瓶中吸取1ml液体注入到2号瓶中,摇匀。
9.1.5重复上述操作程序,根据含菌量多少稀释到最后所需浓度。
9.1.6放入恒温箱中培养。
9.1.7腐生菌培养7d,测试瓶中液体由红色变为黄色或浑浊,即表示有腐生菌生长。
硫酸盐还原菌培养14-21d,测试瓶中液体变为黑色,即表示有硫酸盐还原菌生长。
9.2自制液体测试瓶/液体试管法
在分析中,测试瓶和试管可互换通用,但要注意分析厌氧的硝酸盐还原菌NRB、厌氧发酵菌FMB、硫酸盐还原菌SRB、产甲烷菌MPB这四类菌时应选用厌氧试管。
9.2.1产甲烷菌的分析
培养基的成分:
表1产甲烷菌培养基(g/L)
药品
加量(g)
K2HPO4.3H2O
0.4
NH4Cl
1.0
KH2PO4
0.2
MgCl2。
6H2O
0.1
胰蛋白胨
酵母膏
L-盐酸半胱氨酸
0.5
0.1%刃天青
1ml
乙酸钠
2.0
微量元素浓缩液
甲酸钠
复合维生素浓缩液
H2/CO280:
20充满试管空间
使用前每5ml培养基加入0.1ml1%Na2S和0.05ml10%NaHCO3
配制水
蒸馏水
PH
7.0—7.2
实验步骤:
1)无氧无菌储液的制备:
先用煮沸除氧、通高纯N2至冷却的蒸馏水作为配剂水。
配制以下溶液:
0.1%刃天青。
1%Na2S和10%NaHCO3的溶液,配制过程中继续通入高纯N2,最好压盖后能保持2个大气压。
微量元素浓缩液(配方见表2):
先将4.5克N(CH3COOH)3溶于90ml含NaOH1.8克的水溶液中,再加入其它药品,定容至100ml。
表2:
厌氧用微量元素溶液成分(g/100ml)
加量
N(CH3COOH)3
4.5
FeCl2.4H2O
MnCl2.4H2O
CoCl2.6H2O
0.12
AlK(SO4)2
0.01
ZnCl2
NaCl
CaCl2
0.02
Na2MoO4
H3BO3
无氧蒸馏水
#N(CH3COOH)3先溶于碱。
避光保存
复合维生素浓缩液(配方见表3)。
表3复合维生素浓缩液成分(mg/100ml)
生物素(Bioton)
盐酸吡哆醇(PyripoxinHCl,VB6)
10
硫胺素(ThiamineHCl,VB1)
5.0
D-泛酸钙(D-CalcuinPantothenate)
硫辛酸(Thiocticacid)
叶酸(Folicacid)
烟酸(Nicotinicacid,VB2)
VB12
核黄素(Riboflavin,VB3)
对氨基苯甲酸(P-aminobenzicacid)
#存于冰箱,避光保存。
2)培养基的制备:
采用煮沸除氧
根据需要按表1比例逐一加入除Na2S、NaHCO3和半胱氨酸盐外的试剂,调PH为7.0左右,把培养基装入锥形瓶中,划一刻度,另加适量蒸馏水(1L培养基约加200ml蒸馏水),煮沸至原刻度;
通入无氧N2去除气相中的空气;
停止加热10分钟左右加入半胱氨酸盐,注意继续通入无氧N210分钟,此时培养基颜色由兰紫色逐渐褪成浅粉色;
在厌氧箱内或高纯N2保护下在厌氧箱外分装培养基。
为便于10倍系列稀释,每只测试瓶9ml培养基,为避免漏气,用新的异丁橡胶塞塞紧后加压铝盖。
3)灭菌
将培养基、1%Na2S和10%NaHCO3的溶液、2ml注射器、针头等物品在0.1MPa(121℃)下灭菌20~30分钟。
4)测试方法
调试好厌氧箱并将所需无菌用品移入厌氧箱;
对灭菌后的测试瓶进行编号,根据不同样品来源估计菌数,确定最高稀释度;
每管培养基用无菌注射器加入0.2ml1%Na2S和0.1ml10%NaHCO3。
用经无氧氮气置换的灭菌注射器从预处理后的样品中抽取1.0ml样品做10倍系列稀释接种,并通入H2/CO2为80:
20的混合气。
每一组均应留一不接种的空白作对照。
测试瓶的稀释接种见附录A:
测试瓶法测细菌总数
5)培养方法
产甲烷菌在培养箱内恒温倒置培养,一般温度为平均油藏温度和35℃,如果有特殊需要可视具体情况而定。
6)阳性管的检出
阳性管,即有待测菌生长的稀释管。
培养2~3周后,用气相色谱测定各稀释管中甲烷的含量,以判定产甲烷菌是否生长,检出阳性管。
7)菌浓的计算
菌浓的计算方法见附录B。
9.2.2厌氧发酵菌的分析
表4厌氧发酵菌培养基
K2HPO4
0.8
MgSO4
KCl
CaCO3
微量元素10倍浓缩液
0.9ml
蛋白胨
复合维生素10倍浓缩液
0.5ml
2.5
葡萄糖
7.0
#适用温度为<
90℃
1)培养基的制备
按表4配制培养基,再用1NNaOH或HCl调PH。
发酵菌培养基应先煮沸除氧:
在培养基中加适量蒸馏水(1L培养基约加200m蒸馏水),煮沸至原体积时停止加热,立刻通入高纯N2气10~20分钟,然后可在厌氧箱中或厌氧箱外氮气保护下分装。
每瓶分装9ml培养基,用压盖器压上铝盖。
在厌氧箱外分装时,气针需插入测试瓶中,通高纯N2弱气流(对脸能感觉即可),培养基冒泡数秒后,拔针同时塞紧胶塞。
2)灭菌
将这些物品及1ml注射器、针头在0.056MPa(112℃)下灭菌25分钟。
3)测试方法
测试可用单组或多组测试瓶,有条件的实验室最好在无菌间操作。
将测试瓶编号,每组留一瓶空白培养基作对照,编号为“0”,具体操作见附录A:
细菌测试瓶法。
4)培养方法
接种后,放入培养箱中培养,14天后以培养基的混浊判断厌氧菌的存在。
特别注意观察测试瓶底部,厌氧菌在底部生长较多。
如空白样有菌生长,应重做。
5)菌浓的计算
9.2.3硫酸盐还原菌(SRB)的分析
培养基配方见表5。
表5硫酸盐还原菌培养基
加量(g/L)
乳酸
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