柑橘溃疡病生防菌株CQBS03的鉴定及其培养特性研究Word文件下载.docx
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【结果】经鉴定CQBS03为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
CQBS03抑菌活性成分主要存在于培养液中,能被80%饱和度硫酸铵沉淀,最高可耐受的温度范围为60~70℃;
活性成分在280nm处有最大吸收峰,分子量大于10kD,对蛋白酶K和胰蛋白酶稳定,而对氯仿部分敏感。
培养特性研究表明,CQBS03最适培养基为YPG液体培养基,抑菌物质产生的最适培养条件为:
pH8.0左右,28℃培养72h。
【结论】枯草芽孢杆菌CQBS03所产生的抑菌物质主要成分是蛋白质,且属于外泌型蛋白;
该抑菌蛋白对多种植物病原菌有抑菌作用,尤其对柑橘溃疡病菌抑菌活性高,稳定性好,是一株极具开发潜力的生防菌株。
关键词:
枯草芽孢杆菌;
拮抗细菌;
生物防治;
柑橘溃疡病;
抑菌蛋白
EvaluationofBacillussubtilisStrainCQBS03AgainstXanthomonasaxonopodispv.citri
CHENLi,WANGZhong-kang,HUANGGuan-jun,CAOYue-qing,XIAYu-xian,YINYou-ping
(TheKeyLaboratoryofGeneFunctionandRegulationofChongqingMunicipalEducationCommission,TheBioengineeringCollegeofChongqingUniversity,Chongqing400030)
Abstract:
【Objective】CitrusbacterialcankercausedbyXanthomonasaxonopodispv.citri(Xac.)isoneofthemostimportantplantdiseases.Theaimsoftheexperimentareatscreeninghigheractivitiesantibacterialstraintocontrolthisdisease,andstudingtheantibacterialsubstancecharacteristics.【Method】ThebacterialstrainCQBS03wasisolatedfrommicroorganismfloraofcitrusleafsurface.Thestrainwasidentifiedbasedonthebacteriologicalcharacteristicsandthe16SrDNAsequence.ThecultureconditionsofCQBS03strainwereoptimizedbysinglefactorandorthogonalexperiment.CrudeantibacterialsubstancewasobtainedbyammoniumsulfatefromfermentedliquidoftheCQBS03strain,andthethermalstable,optimumreactivetemperatureandpHweretested.【Result】ThestrainwasidentifiedasBacillussubtilis.TheantibacterialactivitysubstancefromCQBS03coulddesignateasonekindofproteinbasedonthelargemolecularweight(morethan10kD),unstableathighertemperature(60℃to70℃),partlysensitivetochloroform,stabletoproteinaseKandtrypsin.TheoptimalcultureconditionsofthebacteriafortheantibacterialproteinproducingarepH8.0,28℃inyeast
peptone
glucoseliquidmediumwithshakingfor72h.【Conclusion】AntibacterialsubstanceexcretedbyBacillussubtilisCQBS03isantibacterialprotein.IthashighactivitytoXac.TheCQBS03straincanbedevelopedasapromisingbio-controlbacteriumstrain.
Keywords:
Bacillussubtilis;
Antagonisticbacteria;
Biocontrol;
Xanthomonasaxonopodispv.citri;
Antibacterialprotein
0引言
【研究意义】柑橘溃疡病是国内外柑橘生产上的重要病害,其病原菌为地毯草黄单胞柑橘致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.citri,Xac),是国内外重大检疫性有害生物。
在美国、巴西、澳大利亚、中国等大多数国家和地区的非疫区,对外来入侵的柑橘溃疡病一般采用挖树烧毁法根除,该病给这些国家和地区的经济造成重大损失[1,2]。
而在病区,人们采取化学防治为主、农业防治为辅的综合防治策略控制病菌危害。
但化学保护法也只能在一定程度上降低发病率,而且病原菌会对一些药物产生耐药性。
同时大部分使用的化学农药会在柑橘果实上残留且对环境有一定的污染。
而用生物防治方法由于采用自然界本身存在的生物或其产物,对环境友好,而且生防制剂的毒性普遍也较低,不易在果实上残留,因而受到人们的广泛关注。
【前人研究进展】关于柑橘溃疡病拮抗微生物方面的研究国内外虽有不少报道,但尚处于探索阶段[1,3~5]。
已知对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的微生物有草生欧氏杆菌[Erwiniaherbicola(Lohnis)Dye1964,268]、枯草芽孢杆菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn1872,174]、荧光假单胞菌(PseudomonasfluorescensMigula1895,29)和丁香假单胞杆菌(PseudomonassyringaevanHall1902,141)以及腐生的Xanthomonasspp.[1,3,5]。
在国内,周吉奎等[4]报道了K-2与K-8两种细菌在温室和大田防治试验中对柑橘溃疡病表现出良好的防治效果,但未确定这两种细菌的分类地位。
谭小艳等[5]从柑橘园土壤中分离筛选到1株对柑橘溃疡病菌具有抑制作用的鲍氏不动杆菌Bt8,研究了温度、pH及培养基等因素对该菌株的抑菌效果的影响以及在温室条件下菌悬浮液对柑橘叶片上病斑的抑制效果,但对Bt8菌株的抑菌活性成分没有进一步研究。
【本研究切入点】广泛分布于各种微生态环境的芽孢杆菌,因具有抗逆性强的内生芽孢,在土壤和植物表面普遍存在,它能产生抗生素、抗菌蛋白等活性物质,可以通过竞争、拮抗作用、诱导植物抗性等方式控制病害[6],是一类重要的生防细菌。
目前国内外尚无关于柑橘溃疡病生防菌枯草芽孢杆菌拮抗物质方面的报道。
【拟解决的关键问题】本研究从柑橘植株叶面分离到的一株具有广谱拮抗作用的细菌菌株CQBS03,对该菌株的分类地位、生理生化特性以及菌株的抑菌谱等进行较为详细的研究,并对该菌对柑橘溃疡病菌的拮抗作用及其活性物质进行初步探讨,将为确定该菌株的抑菌机制和生防菌剂开发及其应用奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌株来源与培养基
菌株CQBS03,分离自柑橘叶面,经分离纯化后保存于重庆大学基因工程中心。
CQBS03菌的活化培养基为LB固体培养基[7]。
液体培养采用YPG培养基(培养基配方为:
酵母膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml,pH7.0),28℃振荡培养。
1.2供试的其它菌株与培养
柑橘溃疡病菌(Xac01)和参试的其它植物病原微生物包括柑橘绿霉(Penicilliumdigitatum)、柑橘青霉(P.italicum)、柑橘炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、柑橘芽枝霉(Cladosporiumherbarum)和玉米青枯菌(Fusariumoxysporum)均由重庆大学基因工程研究中心提供。
以上菌株在PDA培养基上28℃培养供试。
1.3拮抗菌株CQBS03的抑菌活性测定
采用改良的纸碟法[7]测定CQBS03菌抑菌谱:
配制PDA平板,在冷凝平板上分别加入100μl活化待测靶标菌悬液(Xac01、青霉、绿霉、柑橘炭疽菌、玉米青枯病菌和柑橘芽枝霉菌),涂抹分散[7]均匀制成待测平板。
在每个平板上均匀放置3个各加有10μlCQBS03菌悬液的6mm滤纸片,28~30℃培养,每处理设3次重复,同时用无菌水代替靶标菌菌悬液作为对照(CK)。
分别在培养24、48和72h时对CQBS03菌株产生的抑菌圈进行观察,测量记载抑菌圈大小,以评价其对参试靶标病原菌的抑制作用。
1.4菌株CQBS03鉴定
菌株的形态学和生理生化性状分析按照常规细菌学方法[8~11]进行。
对菌株CQBS03的16SrDNA序列鉴定方法如下:
将活化的CQBS03接种在LB平板上,28℃培养过夜,采用细菌单菌落直接PCR扩增法,扩增制备细菌DNA。
PCR扩增采用细菌通用引物[9],序列为:
Primer1(F27):
5'
-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'
,Primer2(R1492):
-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'
。
PCR反应体系为:
10×
Buffer2.5μl,MgCl22μl(25mmol·
L-1),dNTPsMixture(各10mmol·
L-1)0.5μl,Primer1和Primer2各1μl(10μmol·
L-1),DNAPolymerase(5U·
μl-1)0.2μl,Template1μl,ddH2O16.8
μl,总体积25μl。
PCR反应条件为:
94℃5min;
94℃30s,50℃1min,72℃2min,30个循环;
72℃10min。
反应结束后,取5μl反应液用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物,委托上海英骏生物技术公司进行双向序列测定。
将测定结果与数据库信息比对分析,结合菌落菌体形态及生化测定确定生防菌株种类。
1.5CQBS
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- 柑橘 溃疡 病生防 菌株 CQBS03 鉴定 及其 培养 特性 研究
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