ISO4833菌落总数的检测方法Word文档下载推荐.docx
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菌落总数测定——卫生学意义
判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
及时反映食品加工过程是否符合卫生要求,为被检食品卫生学评价提供依据。
通常认为,食品中细菌数量越多,则可考虑致病菌污染的可能性越大,菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDABAM菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液(磷酸盐缓冲液)
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
(每个稀释度做两个平行)
每皿内加入适量平板计数琼脂(PCA)
35℃48±
2h
菌落计数
FDABAM菌落计数方法
选择25~250CFU之间的菌落进行计数,计算公式如下:
N=∑C/(1*n1+0.1*n2)*d
所有平板的菌落数都不足25CFU,报告EAPC/ml(g)为<25*1/d。
EAPC:
estimatedaerobicplatecount
所有平板的菌落数都超过250CFU,但不足100/cm2,报告EAPC/ml(g)为最接近250CFU的平板菌落数的估计值,乘以相应的稀释度。
所有平板的菌落数都超过100/cm2,计算平板的面积(直径为90mm的平板面积为65cm2),估计最高稀释度每cm2的菌落数,乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果,报告EAPC/ml(g)为>65*100*1/d。
无法计数的平板报告LA(LaboratoryAccident)。
最终结果保留前两位有效数字。
按照4舍6入,5是奇进偶不进。
ISO4833-2003菌落总数测定流程
每皿内加入适量(12~15mL)
平板计数琼脂(PCA),
30±
1℃,72±
3h
ISO4833-2003菌落计数方法
选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板,且一个平板至少含15CFU进行计数,计算公式如下:
N=∑C/(n1+0.1*n2)*d
所有平板的菌落数都不足15CFU,计算2平板菌落的算术平均值m,液体样品:
NE=m
固体样品:
NE=m×
d-1
无菌生长:
液体样品:
lessthan1;
lessthan1×
菌落总数测定几点说明
由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养,因而并不是样品中实际的总活菌数,一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌,均难以反映出来。
鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在,因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块,也可以来源于单个细胞,因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数,而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位(colonyformingunits,CFU)报告。
菌落总数测定几点要求
每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min,主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。
样液与琼脂应充分混合,避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。
皿内琼脂凝固后,不要长时间放置,然后倒置培养,可避免菌落蔓延生长。
检样过程中应用稀释剂做空白对照,用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。
同时,检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂,其暴露时间应与检样时间相当,以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。
检样稀释液有时带有食品颗粒,为避免与细菌菌落发生混淆,可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿,不经培养,于4℃放置,以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名,而是根据卫生学方面的要求,提出的与粪便污染有关的细菌,即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
根据进一步的生化试验,可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌(俗称大肠杆菌)、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义
大肠杆菌(也称大肠埃希氏菌),分类于肠杆菌科,归属于埃希氏菌属。
大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验(靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验)为++--或-+--的细菌。
与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌,包括五种:
肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、致病性大肠杆菌(EPEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、黏附性大肠杆菌(EAEC)。
卫生学意义
大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标,作为食品中的粪便污染指标。
食品中检出大肠菌群,表明该食品有粪便污染,既可能有肠道致病菌存在,因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。
大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近,它的出现预示着某些肠道病原菌的存在,因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
近年来,有些国家在执行HACCP管理中,将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
培养特性:
大肠杆菌合成代谢能力强,在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃,在42-44℃条件下仍能生长,生长温度范围15-46℃
大肠菌群及大肠杆菌测定
——MPN法检验流程(FDABAM)
检样50g+450ml稀释液
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液,
每个稀释度接种三管LST肉汤(每管9mlLST肉汤并加有导管),
每管接种1mL
35℃,24±
2h~48±
没有产气管
有产气管
报告阴性
接种BGLB肉汤管
接种EC肉汤
44.5±
0.5℃(水浴培养)
24±
查MPN表报告结果
产气管接种EMB平板(35℃、18~24h)
(大肠菌群)
从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜
面,进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接
种LST复检产气
查MPN表报告结果(大肠杆菌)
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
MPN检索表:
MPN检索表只给了三个稀释度,如改用不同的稀释度,则表内数字应相应降低或增加10倍。
初发酵和证实试验:
1)两步法进行了两次乳糖发酵试验。
初发酵和证实实验所用培养基不同,但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义,即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
2)初发酵阳性管,不能肯定就是大肠菌群细菌,经过证实试验后,有时可能成为阴性。
有数据表明,食品中大肠菌群检验步骤的符合率,初发酵与证实试验相差较大。
因此,在实际检测工作中,证实试验是必需的。
产气量与倒管:
在乳糖发酵试验工作中,经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小),有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。
实验表明,大肠菌群的产气量,多者可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡。
如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时,可以用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应作进一步试验。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆菌菌落特征:
中心黑色或紫红色,有或无绿色金属光泽
EMB是一种弱选择性培养基,一些球菌也可在该培养基上生长;
高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色,轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色,倾注平板前应先摇匀;
大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽;
该培养基受可见光易使其中的成分氧化,储存及培养细菌时都应在避光条件
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤:
将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗;
滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗;
滴加95%乙醇脱色约15~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗;
滴加番红复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
结果:
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
大肠杆菌测定——生化鉴定
(表略)
金黄色葡萄球菌——概述
根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》,按葡萄球菌的生理化学组成,将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus),其中金葡多为致病性菌,表葡偶尔致病。
金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。
可引起局部化脓性感染,如疖、
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