细胞实验的基本操作Word文件下载.docx
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最后在瓶上做好标记,如细胞代数、日期及姓名等。
1.5、继续培养:
1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在
瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。
2、悬浮细胞的传代
悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉,只留下少量,然后加入新鲜培养液即可。
当细胞悬液中碎片或颗粒物较多,感觉到比较脏时,可以将悬液移到离心管内,1000~1500rpm离心3分钟,弃上清,加入约2ml培养液,吹打至均匀,滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。
然后置于二氧化碳培养箱中培养(拧松培养瓶盖)。
三、细胞的冻存
细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温,以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。
1、具体操作如下:
1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存,但最好选择对数增长期细胞,已长满的细胞冻存复苏后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
1.2、贴壁细胞经消化、离心(1000~1500rpm,5min)收集,悬浮细胞经离心收集;
1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液(10%DMSO+90%血清),用吸管吹打,使细胞分散成单细胞悬液;
1.4、加入到冻存管中,每个冻存管加1-1.5ml的细胞悬液;
密封;
1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期;
1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内,管置于4℃半小时,然后置于-20℃两小时,再置于-70℃两小时,然后置于液氮上方过夜;
第二天将细胞置于液氮中;
1.7、记下冻存管存放的位置,作好冻存记录(冻存的细胞名称、代数、冻存日期等)。
2、注意事项:
2.1、使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破华它的分子结构,以
至于降低冷冻保护效果。
在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时最好戴上手套操作。
2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危
险温区”。
2.3、注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。
2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。
但为妥善起见,特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存
后要在短期内复苏一次,观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后,再继续
冻存。
四、细胞计数
实验原理:
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作如下:
1、准备工作:
取一瓶传代的细胞,按上述二的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以使用。
2、细胞悬液制备:
细胞悬液的制备方法:
用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测单细胞悬液。
3、细胞计数:
2.1、盖好盖玻片:
取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.2、制备计数用的细胞悬液:
用吸管吸适量细胞悬液(如5滴)到一离心管中,加入等体积台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
若仅是单纯的进行细胞计数,不考虑细胞的活力,则可省略台盼蓝染色步骤。
2.3、、将细胞悬液滴入计数板:
将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
2.4、统计四个大格的细胞数:
将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大格(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
2.5、计算原细胞悬液的细胞数:
按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×
2×
104
说明:
公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:
1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×
1.0mm(宽)×
0.1mm(高)=0.1mm3;
而1ml=1000mm3
细胞计数要点:
①进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培
养液中;
②要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
③取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
④数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
⑤操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
注:
4%台盼蓝母液的配制:
称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
使用时,用PBS稀释至0.4%。
五、细胞活力的测定
1.染料排斥试验:
其原理是细胞损伤或死亡时,某些染料可穿透细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色。
而活细胞则能阻止该染料进入细胞内。
借此可鉴别死细胞和活细胞。
常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。
以台盼蓝染色为例。
步骤同上述细胞计数的操作步骤。
注意以下几点:
①计数:
在3-10min内,用血球计数板分别计数活细胞和死细胞(死细胞被染成淡蓝色,活细胞则拒染)。
②台盼蓝染色时,时间不宜太长,否则活细胞也会着色,从而干扰计数。
③活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×
100%
2、MTT比色实验:
可测定测药物或病毒的IC50
原理:
活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT),还原成紫色不溶性结晶物,沉积于细胞中。
用酸性异丙醇或DMSO溶解后,于酶标仪上测定光吸收值。
紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。
2.1、将细胞接种于96孔板上,密度为大约105个/ml,每孔接种100μl;
2.2、培养至对数生长期加入待测样品;
2.3、作用一定的时间之后,加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液,每孔20μl;
2.4、37℃温育4小时;
2.5、取出培养板,小心吸去上清,注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀;
如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清;
2.6、每孔加入100μl的DMSO,摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解;
2.7、用酶联免疫检测仪(DNAExpert)在595nm(或490nm)波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值
(OD值),按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率:
细胞存活率(%)=治疗组OD值/对照组OD值×
2.8、求出各药物(或病毒)浓度下的OD值占对照OD值的百分比,用此百分比对药物(或病毒)浓度作图;
在所得的曲线上,百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。
或根据各浓度下细胞的存活率,采用Logit
法计算IC50。
六、细胞的运输
装运细胞的方法有两种:
1、冷冻贮存运输
即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存,保存效果较好,但较麻烦,且不能长时间运输,多需空运。
2、充液法
2.1、选生长状态良好的细胞,去掉培养液,充满新培养液,液量要达到培养瓶颈部,拧紧螺帽或塞以胶塞,
保留微量空气。
若空气留量过多,运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。
2.2、妥善包装、运输。
一般在四五天内到达目的地,对细胞活力无多大影响,时间过长则细胞活力下降。
2.3、到达目的地后,倒出大部分培养液,保留维持细胞生长所需的液量,置37℃培养,次日传代。
从其他研究室所取细胞时,应注意了解细胞的性状、培养液、培养时的注意事项等
【细胞转染】
一、脂质体转染(Lipofetmiane2000)
1、转染前细胞的处理(以24孔板培养为例):
贴壁细胞:
在转染前一天,在24孔板内铺上0.5×
105细胞,500ul无抗生素培养基培养一天,到转染时使细胞达到80%~90%的汇合率。
悬浮细胞:
在制备混合物前,将4—8×
105细胞用无抗生素培养基培养铺铺于24孔板内。
2、转染方法(以质粒DNA转染为例)
2.1、将DNA质粒溶于50ul无血清的Opti-MEMⅠReducedSerumMedium中。
混合均匀。
2.2、将适量Lipofectamine2000溶于50ul无血清的Opti-MEMⅠ中,混合均匀。
在室温下孵育5分钟(在25分钟内进行步骤c)。
2.3、孵育5分钟后,将上述两种混合物混合(总体积100ul)。
轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟(可能出现雾状沉淀)。
复合无在室温下六小时内稳定。
2.4、在24孔板中每孔加入100ul的复合物以及适量培养基。
十字法混合均匀。
2.5、细胞在37。
CCO2培养箱中培养18-48个小时后,测量转染效率。
在加完复合物4-6小时候可更换培养基。
3、转染注意事项
3.1、转染严格来说,每种细胞的条件是不一样的,如果实验时,不能确定最佳转染条件,请在细胞实验组共享文件夹查找类似细胞的转染方法;
3.2、转染结果的好坏,与DNA质量密切相关,务必在实验之前对去内毒素质粒DNA的质量进行严格鉴定,至少采用以下两种方法:
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,如果有条件,可对质粒DNA去内毒素质量的进行检测。
细胞相关实验操作方法
【小量细胞样品TotalRNA的提取方法】
一、实验步骤(以细胞为例)
1.1、细胞样品(1.0×
107个)去上清之后,加入1mlTRIzol溶液反复吹打至溶液清亮,转移入1.5mlTube中室温下放置10min,如不能立即提取则放于-80℃保存(可保存一个月),提取时取出放于室温融化;
也可按照正常冻存方法保存1×
107个细胞,提取时37℃迅速融化,5000rpm离心3min去除上清液后迅速加入1mlTRIzol溶液反复吹打至溶液清亮,室温下放置10min;
1.2、加入200ul氯仿(1/5TRIzol体积),先用枪混匀10-15下,再充分颠倒混匀2min,使两相充分混合,室温静置3min;
1.3、4℃、10000g(12000rpm)离心15min;
1.4、小心吸取上清(中间有厚厚的蛋白层)至一新的1.5mlTube中(可取干净),加入0.5ml异丙醇(1/2TRIzol体积)先用枪混匀10-15下,再充分颠倒混匀2min,室温放置10min;
1.5、4℃、10000g(12000rpm)离心10min;
1.6、小心吸去上清液(注意不要吸起白色沉淀),加入1ml70%乙醇(-20℃预冷)旋转漂洗RNA沉淀;
1.7、4℃、10000g(12000rpm)离心5min;
1.8、小心吸去上清液,空气中干燥2-3min,加入84ulDEPC水充分溶解RNA(如溶解困难,4℃放置过夜);
[将RNA稀释5倍,电泳,]
(若是对RNA的质量要求不高,做到这一步即可,以下是纯化的步骤)
依次加入2ulRNase
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- 细胞 实验 基本 操作