模型与实验仪器耗材Word下载.docx
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1.2实验仪器
EP管,型号:
1.5ml,美国Axygen公司;
玻璃匀浆器,型号:
1ml,科瑞生物技术;
移液器,型号:
0.1-2.5μL,0.5-l0μL,20-200μL,100-1000μL,美国Thermo公司;
电子天平,型号:
PL203,梅特勒——托利多仪器;
高压蒸汽灭菌锅,型号:
YXQ-LS-75G,诺基仪器;
全自动干燥箱,型号:
DHG-9640C,公司;
超低温冰箱,型号:
T11-86-340-LA,天地精仪科技;
低温高速离心机,型号:
CR21GⅡ,日本日立公司;
多功能酶标仪,型号:
spectraMAXM5,美谷分子仪器;
Real-TimePCR、WesternBolt检测TGF-β1受体蛋白表达水平
1.实验药品试剂
PCR所用实验用品:
DEPC,科瑞生物技术;
TRIzol,批号:
15596-026,美国Lifetechnologies公司;
氯仿,批号:
100068608,国药集团化学试剂;
异丙醇,批号:
32064,恒兴化学试剂制造;
逆转录试剂盒,批号:
RR047A,宝生物工程()(TaKaRa公司);
SYBRPremixExTaq[TM],批号:
RR420A,宝生物工程()(TaKaRa公司);
Westernbolt所用实验用品:
脱脂奶粉,科瑞生物技术;
Tween-20,科瑞生物技术;
考马斯亮蓝快速染色液,科瑞生物技术;
丽春红染液,科瑞生物技术;
氯化钠,批号:
1266-2006,恒兴化学试剂制造
Glycine,科瑞生物技术;
TrisBase,科瑞生物技术;
SDS,科瑞生物技术;
二甲苯,批号:
10023428,国药集团化学试剂;
HCl,批号:
81013,中国平煤神马集团东大化工;
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒,批号:
P0012A,碧云天生物技术;
TEMED,批号:
ST728,碧云天生物技术;
Western一抗二抗去除液(强碱性),批号:
P0025,碧云天生物技术;
WesternBlot超敏发光液,批号:
P1010,普利莱基因技术;
RIPA裂解液,批号:
P0013,碧云天生物技术;
PMSF,批号:
329-98-6,中生瑞泰科技;
BCA试剂盒,批号:
P0010S,碧云天生物技术;
Prestainedproteinloadingbuffer,批号:
26617,美国Thermo公司;
PrestainedproteinMWmarker,批号:
26616,美国Thermo公司;
5×
Loadingbuffer,科瑞生物技术;
硝酸纤维素膜,批号:
T328591,美国Lifetechnologies公司;
一抗:
GAPDH抗体;
TGF-β1抗体美国millipore公司)
二抗:
羊抗兔二抗,羊抗鼠二抗,鼠抗羊二抗(科瑞生物技术);
大鼠β-actin引物、TGF-β1引物。
英潍捷基()贸易合成并经质量检测。
引物序列见表1。
表1引物序列
目的基因
引物序列
产物长度
β-actin
Forward:
5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′
171bp
Reverse:
5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′
TGF-β1
5′-CAGACTCATGATGACAGAGG-3′
381bp
5′-GAGATGTACAGGATCTTCCC-3′
1.3实验仪器
PCR所需仪器
去酶PCR管,型号:
0.2ml,美国Axygen公司;
八联管、盖,型号:
核酸蛋白分析仪,型号:
DU800型,美国Beckman公司;
RealTime-PCR仪,型号:
CFX96,美国Bio-Rad公司;
梯度PCR仪,型号:
T100,美国Bio-Rad公司;
Westernbolt实验仪器
纯水机,型号:
E30131,英国ELGALABWATER公司;
制冰机,型号:
SD40,市广绅电器制造;
全自动洗板机,型号:
1575,美国BIO-RAD公司;
台式高速离心机,型号:
TG-16W,湘智离心机仪器;
手掌型离心机,型号:
LX-200,海门其林贝尔仪器制造;
转移脱色摇床,型号:
TS-8型,海门其林贝尔仪器制造;
滚轴式混合器,型号:
SRT-202,海门其林贝尔仪器制造;
数显恒温水浴锅,型号:
HH-2,澳华仪器;
旋涡混合器,型号:
QL-901,海门其林贝尔仪器制造;
电脑型倒置荧光显微镜,型号:
DFM-60C,蔡康光学仪器;
激光共聚焦荧光显微镜,日本Olmpus公司;
蛋白电泳仪,美国Bio-Rad公司;
凝胶图像成像分析仪,美国Bio-Rad公司;
1.4westernbolt实验用到的溶液配制方法
10%SDS-PAGE分离胶(2块胶):
蒸馏水2.7ml,10%过硫铵0.1ml,1MTris(pH8.8)3.8ml,10%SDS0.1ml,30%Acr-Bis(29:
1)3.3ml,TEMED0.004ml。
5%SDS-PAGE浓缩胶(2块胶):
蒸馏水2.1ml,10%过硫铵0.03ml,1MTris(pH6.8)0.38ml,10%SDS0.03ml,30%Acr-Bis(29:
1)0.5ml,TEMED0.003ml。
10倍电泳缓冲液:
SDS10g,TrisBase30g,Glycine141.1g,蒸馏水定容至1000ml,充分搅拌至完全溶解,置冰箱4℃保存备用,使用时稀释10倍。
转膜液:
Glycine14.4g,TrisBase3.03g,蒸馏水定容至800ml,充分搅拌至完全溶解,置冰箱4℃保存备用,使用时加入200ml甲醇,使其终浓度为20%。
TBS:
TrisBase3g,NaCl8g,蒸馏水定容至800ml,充分搅拌至完全溶解,置冰箱4℃保存备用,使用时用HCl调pH值至7.4,以蒸馏水定容至1000ml。
TBST:
TBS加0.1%体积Tween-20。
PBS缓冲液:
Na2HPO41.42g,KCl0.2g,KH2PO40.27g,NaCl8g,加入蒸馏水800ml充分搅拌至完全溶解,用HCl调pH值至7.4,用蒸馏水定容至1000ml,高压蒸汽灭菌,置冰箱4℃保存备用。
Real-TimePCR、WesternBolt检测Samd蛋白表达水平及其磷酸化水平
p-Samd抗体(美国millipore公司)
大鼠β-actin引物、Samd引物。
引物序列见表2。
表2引物序列
Samd
5′-CACTGGTTCCGAAAGGGACTC-3′
153bp
5′-CTGAAGCAAAAATCGCCACCT-3′
八联
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