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因此,在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分,而是处于完全的异养状态。
3、组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织,也可以是单个的细胞,它们都处于离体状态下。
细胞全能性不仅表现在二倍体细胞水平,而且也表现在单倍体细胞(如小孢子)和三倍体(如胚乳)水平上,即使是去掉了细胞壁的细胞(原生质体),在组织培养条件下也能再生完整植株。
4、组织培养通过连续继代培养可以不断增殖,形成克隆,或通过改变培养基成分,特别是其中的植物激素的种类和配比,而达到不同的实验目的,如茎芽增殖或生根。
5、组织培养是在封闭的容器中进行的,容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。
容器内内的湿度在通常情况下几乎是100%,因此,组培苗叶表面一般都无角质层或蜡质层,且气孔保卫细胞功能缺乏,气孔始终都是张开的。
6、组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的,找出这些物理因素的最适参数对组织培养的成功也很重要。
三、植物组织培养的应用与展望
概括地说,组织培养系统在农业上的应用有以下几个方面:
1、植物离体快繁
2、病毒苗木培育
3、培育新品种或创造新物种
4、次生代谢物生产
5、植物种质资源的离体保存
6、人工种子
第一章实验室的基本设备和一般技术
本章重点内容:
灭菌技术、培养基
一、灭菌技术
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:
物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;
化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。
1、器具的灭菌
(1)干热灭菌法
利用鼓风干燥箱(烘箱)进行烘烤灭菌的方法。
此法适用于各种玻璃器皿和器械的灭菌消毒。
(2)高压蒸汽灭菌法
利用高压蒸汽灭菌的方法,是目前最常用的一种灭菌方法。
此法适用于培养基、蒸馏水、各种器械、棉塞、包头纸等的灭菌。
2、培养基的灭菌
菌种:
污染的病原分为细菌和真菌两大类。
细菌污染的特点是菌斑呈粘液状,而且在接种2-3天后即可发现。
真菌污染的特点是在接种5-10天才能发现不同颜色的霉菌。
发现污染的材料应及时处理。
污染来源:
培养基的污染有几个可能的来源:
①培养容器;
②培养基本身;
③外植体;
④接种室的环境;
⑤在接种和继代时用以操作植物材料的器械;
⑥培养室的环境。
灭菌方法:
(1)高压蒸汽灭菌法
(2)过滤除菌法
一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。
3、外植体(植物材料)灭菌
(1)首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。
把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。
(2)对材料的表面浸润灭菌。
要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。
用70%酒精浸10-30s。
(3)灭菌剂处理。
表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见表4-2。
表4-2常用灭菌剂使用浓度及效果比较表(简单了解)
灭菌剂
使用浓度
持续时间/min
去除的难易
效果
次氯酸钙
90%~10%
5~30
易
很好
次氯酸钠
2%
氯化汞
0.1%~1%
5~8
较难
最好
抗菌素
4~50mg/L
30~60
中
较好
灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。
(4)最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-10次左右。
无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
外植体消毒的步骤如下所示:
二、培养基
(一)培养基的成分
培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机化合物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
1、水
2、无机元素:
包括大量元素和微量元素
3、有机化合物
常加入的有机成分主要有以下几类:
(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖。
蔗糖使用浓度在2%~3%,常用3%,即配制1L培养基称取30g蔗糖,有时可用2.5%,但在胚培养时采用4%~15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。
(2)维生素
(3)肌醇
(4)氨基酸
(5)植物激素
●生长素类:
在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。
●细胞分裂素类:
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:
①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长,细胞分裂素与生长素相互作用,当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时,诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。
②促进细胞分裂与扩大。
③抑制根的分化。
因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖,而避免在生根培养时使用。
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织、是长根还是长芽。
如为了促进芽器官的分化,应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。
4、天然复合物
5、培养材料的支持物
(二)培养基的类型
1、含盐量较大的培养基
如MS培养基和改良的MS培养基。
该类培养基有利于愈伤组织的诱导、生长和细胞培养,是应用范围最广和适应性最强的培养基。
2、硝酸钾含量较高的培养基
这类培养基盐浓度也很高,尤其是硝酸钾的含量较高,如B5、N6、SH。
在禾谷类植物的花药、花粉和原生质体培养中得到广泛应用。
3、含盐量中等的培养基
这类培养基中大量元素为MS的1/2,微量元素种类减少,但含量增加,维生素种类比MS多,如H培养基。
4、低盐浓度的培养基
这类培养基包括White培养基WS和HE培养基等,其中white培养基由于无机盐的数量比较低,更适合木本植物的组织培养。
第二章植物组织培养的基本原理
一、概念:
植物细胞全能性是指植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜能,即植物细胞具有该植株全部遗传可能性,在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
细胞分化是指导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。
细胞脱分化:
即失去分化细胞的典型特征,或消除了细胞分工,使之恢复到分生组织状态,或胚性细胞状态,即细胞脱分化。
再分化:
即脱分化后的分生细胞(愈伤组织)在特定的条件下(离体培养)下,重新恢复细胞分化能力,并经历器官发生形成单极性的芽或根,或经历胚胎发生形成双极性的胚状体,进一步发育成完整植物体,这一过程称为再分化。
二、离体培养形态发生和植株再生
外植体形态发生形成完整植株的途径
三、愈伤组织
(一)愈伤组织的特性
在不同的实验中由于目的的不同,对愈伤组织状态的要求也不完全相同,但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中2~3个特性:
1、高度的胚性或再分化能力,以便从这些愈伤组织得到再生植株。
2、容易散碎,以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系,并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。
3、旺盛的自我增殖能力,以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。
4、经过长期继代保存而不丧失胚性,以便有可能对它们进行各种遗传操作。
为了达到以上目的,我们在诱导愈伤组织时通常采取的策略是:
1、选择适当的基因型和适当的外植体。
虽然几乎所有高等植物的器官和组织都可能产生愈伤组织,但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同,同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同。
2、选择正确的培养基,特别是正确的植物激素的种类和浓度,以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时,二者之间正确的配比。
(二)愈伤组织的形成:
在脱分化过程中,大多数情况下形成愈伤组织。
愈伤组织的细胞结构往往是异质性的,无明显极性,其形成过程可分为诱导期、细胞分裂期和形成期
愈伤组织的形成特点
(三)愈伤组织的形态建成:
外植体细胞在合适的培养条件下发生脱分化,再分化产生芽和根或形成胚状体,发育成苗或完整植株。
1、形态建成的方式:
离体培养条件下,经过愈伤组织再分化器官一般要经过3个生长阶段。
第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。
(愈伤组织的诱导,分裂,形成期)
第二阶段是“生长中心”形成。
第三阶段是器官原基及器官形成。
二、影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素
愈伤组织诱导、增殖及形态建成是一个连续的过程,主要受起始材料、培养基和培养环境等因素的调控。
图影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素
1、起始材料
(1)物种、基因型
不同物种外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同。
同属不同种,甚至同一物种不同基因型的愈伤组织器官分化的能力也不一样。
基因型是离体培养过程中影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的一个重要因素。
(2)外植体类型与生理状态
以不同器官作为外植体诱导的愈伤组织,其器官发生能力因植物而异,有的植物差别不大,有的则明显不同;
外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力。
2、培养环境
(1)温度:
一般情况下愈伤组织诱导和增殖的最适温度为(25±
2)℃
(2)光:
光对愈伤组织的诱导和增殖及分化既有促进作用,又有抑制作用。
光的作用反映在光照时间、方式、强度及波长上,一般光照强度为1500~2500lx。
3、培养基
(1)生长调节物质
培养基中生长调节物质对愈伤组织诱导及增殖起重要的调节作用。
在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中,调控幅度最大的是植物生长调节物质,主要调节生长调节物质的种类、浓度和比例,其中生长素和细胞激动素的浓度和配比对外植体愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的调控起重要作用。
Skoog和Miller提出“激素平衡”假说,即高浓度的生长素有利于根的形成,而抑制芽的形成,反之,高
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