基因工程试验综合.docx
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基因工程试验综合
实验一大肠杆菌基因组DNA提取与检测
一、目的要求
1.学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA;
2.学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度
二、基本原理
本实验利用TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。
该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞,由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA,然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质,再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。
三、实验材料
1.实验菌株:
大肠杆菌TG1
2.实验试剂:
LB液体培养基
TaKaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0试剂盒
无水乙醇
3.实验仪器:
移液枪,低温离心机,水浴锅,eppedorf管,振荡器
四、操作步骤
1.大肠杆菌的培养:
从平板培养基上挑选单菌落接种至1~4ml的液体培养基中过夜培养。
2.取1~4ml的过夜培养菌液,10,000rpm离心2分钟,弃上清。
3.用150μl的SPBuffer(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀。
注)注意不要残留细小菌块,可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4.加入20μl的Lysozyme溶液,均匀混合后室温静置5分钟。
5.加入30μl的EDTABuffer,均匀混合后室温静置5分钟。
6.加入200μl的SolutionA,剧烈振荡后65℃保温10分钟。
注)①若SolutionA出现沉淀,请于65℃加热溶解,待恢复至室温后使用。
②65℃保温10分钟后,溶液将由乳浊液变成透明液。
如果此时溶液没有变成透明,说明细菌没有裂解,基因组DNA将不能释放。
7.加入400μl的SolutionB,剧烈振荡15秒。
注)若SolutionB出现沉淀,请于65℃加热溶解,待恢复至室温后使用。
8.加入650μl的SolutionC,上下颠倒均匀混合。
9.12,000rpm离心1分钟。
10.先弃去上层有机相,然后将水相溶液(无色下层)移入预先置于1.5ml离心管上的FilterCup中,12,000rpm离心1分钟。
注)有机相(上层)请务必除尽,否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。
11.弃FilterCup,在滤液中加入450μl的DBBuffer,混合均匀。
12.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。
13.将上述操作11的混合液转移至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。
14.将500μl的RinseA加入至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。
15.将700μl的RinseB加入至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。
注)请确认RinseB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
请沿SpinColumn管壁四周加入RinseB,这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
16.重复操作步骤15。
17.将SpinColumn安置于CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。
18.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。
注)把水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。
19.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
20.取5μlDNA洗脱液用琼脂糖电泳进行检测
20.取10μlDNA洗脱液用分光光度计检测其浓度及纯度,其余-20℃保存
实验二基于16SrRNA基因的PCR扩增、电泳和胶回收
一、实验目的
1.了解PCR扩增DNA的技术及原理;
2.学习PCR扩增仪的使用;
3.学习琼脂糖凝胶的制备和电泳方法;
4.了解DNA胶回收的原理及方法。
二、实验原理
随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,16SrDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。
细菌中包括三种核糖体RNA,分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。
16SrDNA是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA的基因,长度为1540bp,相比较5SrRNA和23SrRNA而言,长度适中,又具有保守性和存在的普遍性,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”,因此,现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对细菌进行测序分析。
16SrDNA鉴定是利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA的提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤,是一种快速获得细菌种属信息的方法。
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应,是一种体外DNA扩增技术。
PCR的工作原理(图1)类似于DNA的体内复制过程,是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环,使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。
PCR扩增首先需要一对引物,根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物,引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。
反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。
PCR反应循环的第一步为加热变性,使双链模板DNA变性为单链;第二步为复性,每个引物将与互补的DNA序列杂交;第三步为延伸,在耐高温的DNA聚合酶作用下,以变性的单链DNA为模板,从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。
这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA。
PCR反应一般30-40次循环,DNA片段可放大数百万倍。
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增,变性温度为95℃,复性温度为37℃~55℃,延伸合成温度为72℃,DNA聚合酶为Taq酶(可耐受95℃左右的高温而不失活),反应循环数为30。
图1PCR反应原理
PCR是否成功,需要利用琼脂糖电泳进行检测。
琼脂糖电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
PCR后往往有非特异条带出现,为了获得专一的目的条带,所要对PCR产物进行切胶回收。
胶回收是利用特殊硅基质材料在高盐、低pH值情况下吸附DNA,在低盐、高pH值情况下释放DNA的原理纯化获得目标DNA。
DNA胶回收后同样需要利用电泳进行检测。
三、实验材料
1、实验器材
PCR扩增仪,台式高速离心机,移液器,灭菌后的PCR管,电泳仪,凝胶成像仪等。
2、实验试剂
(1)模板DNA(0.1µg/µl)。
(2)TaqDNA聚合酶(5U/µl),10×扩增缓冲液,dNTP(1mmol/l)
(3)引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)(20µmol/l)
(4)TAE缓冲液(50×)(pH8.0):
每升溶液中含有242gTris,57.1ml冰乙酸,100ml0.5mol/lEDTA。
电泳时稀释成1×浓度使用。
(5)溴酚兰-甘油指示剂:
先配制0.1%溴酚兰水溶液,然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成。
(6)0.5μg/ml溴乙啶染液:
称取5mg溴乙啶,用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1×TAE缓冲液稀释到1升,最终浓度为0.5μg/ml。
(7)琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根,中国)
四、实验步骤
1、准备PCR反应溶液
(1)按以下次序,将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合:
模板DNA1µl
10×扩增缓冲液5µl
4×dNTPs(包括四种dNTP,100µmol/l)1µl
27F1µl
518R1µl
TaqDNA聚合酶1µl(2.5U)
加水至终体积50µl
(2)用手指轻弹Eppendorf管底部,使溶液混匀。
在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。
(3)加石蜡油10µl封住溶液表面。
2、PCR扩增反应
将混有菌体的PCR管置于PCR扩增仪内,95℃5分钟,使模板DNA完全变性。
然后按95℃变性30秒,50℃退火45秒,72℃延伸2分钟,重复循环30次,循环结束后72℃延伸10分钟。
反应完毕,将样品取出置-4℃待用。
3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
(1)制胶:
称取琼脂糖粉末,置于三角瓶中,加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度,加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中,待溶液温度降至65℃时,立即倒入制胶槽中,插入样品梳。
在室温放置0.5~1h,待凝胶全部凝结后,轻轻拔出样品梳。
然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。
(2)加样:
取5µlPCR产物,加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂,混匀后小心地加到样品槽中。
同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液,在同一凝胶板上进行电泳。
(3)电泳:
维持恒压100V,电泳0.5~1h,直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部,停止电泳。
(4)染色:
将凝胶取出后浸入0.5mg/ml溴乙啶溶液中,染色0.5~1h。
染液可反复多次使用。
(5)观察:
将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察,DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。
4、PCR产物胶回收
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。
(1)柱平衡步骤:
向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
(请使用当天处理过的柱子)
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中,称取重量。
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100µl,则加入100µlPN溶液),50℃水浴放置,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块,可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液,直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大,可事先将胶块切成碎块)。
注意:
对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率;胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中),室温放置2min,12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CA2放入收集管中。
注意:
吸附柱容积
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