分子生物学与细胞生物学实验基本技术2Word下载.docx
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3、加样
1)DNA变性:
将DNA样品与载样缓冲液(含50%去离子甲酰胺的pH8.0
20mmol/LTris-HCL)混合,在90-95℃加热3-5分钟,然后立即置于冰浴中。
使双链DNA片段变性成为单链DNA。
2)每孔加样量5-15ul。
4、电泳
在10-15℃下电泳.开始在20W电泳,待样品进入胶后,再调节功率至30W,电泳1-3小时。
若以恒定电压进行电泳,电压可维持在10-20V/cm。
电泳结束后取下凝胶,将其浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×
TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染。
5、银染法
1)将凝胶用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定30min,不断摇晃。
2)倒掉固定液,用去离子水洗二次。
3)再浸入染色液(0.15%AgNO3)中,染色10分钟。
4)倒掉染色液,用去离子水洗3--5次。
5)将凝胶浸入显色液(0.5%NaOH和0.15%甲醛)中显色,直至条带显示最佳颜色(约10min)。
6)立即倒掉显色液,加入终止液(10%冰乙酸),终止反应。
.
7)将凝胶置无水乙醇中脱水,凝胶图象分析仪观察拍照,或将凝胶封入塑料袋中,可以保存较长时间。
五、注意事项:
1.PCR-SSCP只能作为一种突变检测方法,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序。
2.由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
3、经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,90%可被SSCP发现。
3.在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数)
丙烯酰胺(%)
1Kb~700b
3.5
700b~500b
5
500b~200b
8
200b
12
审
实验二十PCR-RFLP
掌握PCR-RFLP方法及其在基因突变检测中的应用
PCR-RFLP技术:
PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthPolymorphism,RFLP)分析.PCR-RFLP主要有三个环节:
(1)靶基因PCR扩增;
(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性).该术应用PCR将目的基因片段扩增百万倍以上,即使被测样品核酸量小于pg水平,也能被扩增出来,这不仅大大提高了基因分析的灵敏度,而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR-RFLP主要用于核酸变异性分析与比较,当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排,使某种酶切位点增加,减少或消失,导致限制性酶切片段长度发生改变,就产生了限制性片段长度多态性,由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点,根据其识别序列的位置和数量,可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳,可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小).PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高,重复性好,简便快速直观等优点,主要用于微生物的分群分型分亚型,癌基因分析,遗传病的诊断,HLA分型及载脂蛋白基因的分析等.
三、材料及试剂
1.ALW261内切酶及反应buffer
2.PCR产物样品
3.去离子水
4.eppendorf管及Tip头
5.PCR仪
6.标记笔、无粉手套等
四、操作步骤
1.设置20ul反应体系,在200ulEP管中加入:
PCR产物样品17.5ul
10×
buffer2ul
ALW2610.5ul
2.充分混匀,离心20S。
3.置于PCR议上37℃反应过夜
4.用6×
上样buffer上样电泳(1.5%琼脂糖凝胶)
5.凝胶成像及观察
实验二一动物组织细胞的裂解与全细胞蛋白提取、浓度测定
掌握动物细胞裂解释放细胞全蛋白及其浓度测定的方法及保存条件
组织细胞在特定的物理化学条件下,释放部分或全部蛋白质,通过离心等步骤加以分离,即可获得蛋白质粗品。
制备细胞裂解物是分离蛋白质的一个重要步骤,裂解细胞的方法取决于不同的实验目的与要求。
Celllysisbuffer1用于释放细胞浆蛋白,Celllysisbuffer11用分离全细胞蛋白,本实验以Celllysisbuffer11为细胞裂解液提取全细胞蛋白。
根据蛋白质性质,测定蛋白质的方法主要有:
Bradford法:
蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量不同,其OD595值也不同,与OD595成直线关系;
Lowry法:
蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物,此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂产生蓝色;
紫外分光光度法:
蛋白质的芳香族氨基酸在280nm有吸收;
双缩脲法:
凯氏定氮法。
本实验利用考马斯亮蓝法对提取细胞全蛋白质进行定量。
三、试剂与材料
1.Celllysisbuffer11(50mMTris-Cl,150mMNaCl,0.0%NaN3,0.1%SDS,1mMPMSF,1%NP-40,0.5%去氧胆酸钠)
2.低温高速冷冻离心机
3.电动匀浆机
4.移液器
5.EP管
6.Tip头
7.制冰机
8.Bovineserumalbumin(BSA)
9.生理盐水
10.紫外分光光度计或装备有595nm滤光器酶标仪
11.考马斯亮蓝G-250(0.01%考马斯亮蓝G-250,4.75%乙醇V/V,10%磷酸(V/V))
(一)、全细胞蛋白提取
1.组织需用预冷的PBS洗净残血,每100mg组织加入CelllysisbufferⅢ1ml,电动匀浆机匀浆至无完整细胞结构(4℃)。
2.EP管分装,离心(12000g×
20min,4℃)。
3.上清液即为全细胞蛋白质,EP管分装后-70℃保存;
部分用于蛋白质浓度测定。
(二)、蛋白质浓度测定
1.BSA标准管蛋白的配制:
取1.5mlEP管6个,分别加入0.5mg/mlBSA0ull、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul,用0.9%NaCl补足至100ul。
同样方法制备样品。
2.每管分别加入1ml考马斯亮蓝G-250,震荡片刻,室温放置2分钟。
3.加入酶标板或比色皿进行测定,读取OD595nm,以BSA标准管蛋白建立标准曲线和相关方程式,求出被测标本的蛋白质浓度。
五、注意事项
1.制备蛋白质时一般要求在4℃条件下操作,并加入一定的蛋白酶抑制剂,以防蛋白质降解。
2.被检测样品的稀释度应在标准曲线范围内,所以要摸索好条件,再进行检测。
实验二二SDS-PAGEandWESTERNBLOT
熟悉SDS-PAGE电泳方法及其应用,掌握WESTERNBLOT检测蛋白质表达水平
不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同,常用泳动率或迁移率来表示。
泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下电泳的速度。
其影响主要因素有:
带电颗粒净电荷的数量、大小及形状,电场强度,电泳液PH值及粒子强度,电渗作用。
在SDS-PAGE过程中,加入SDS以消除带电颗粒本身电荷的影响,使电泳迁移率只决定于待分离物质分子的大小,与本身电荷无关。
在变性条件下进行单向凝胶电泳,蛋白质在凝胶介质中向阳极泳动时因分子量大小不同而得到分离。
灌制聚丙烯酰胺先灌制分离胶,待分离胶凝固后在其上灌制浓缩胶,然后固定在电泳装置上,蛋白质在SDS存在下煮沸变性溶解,上样电泳后电转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上,与放射性或非放射性物质标记的抗体特异性结合,成像或现色以检测相关抗原的质与量。
三、试剂及材料
1.Proteinmarker
2.Bovineserumalbumin(BSA)
3.Trisbase(ultrpure)
4.SDS(ultrpure)
5.30%Acrylamide/Bis-Acrylamide
6.0.1MPMSF(biotechgrade)
7.Glycine
8.DTT
9.TEMED
10.二巯基乙醇(化学纯)
11.0.5%丽春红(分析纯)
12.5×
SDSelectrophoresisbuffer(0.125MTris,0.96MGlycine,0.5%SDS)
13.2×
SDSlandingbuffer(0.1MTris,20%Glycerol,4%SDS,2%2-ME,tracebromophenolblue)
14.TBST(0.1MTris-Cl,09%NaCl,0.05%Tween-20,PH7.5)
15.Blockingbuffer(TBST+5%non-fatdrymilk)
16.Antibodiesdilutedbuffer(TBST+0.4%BSA)
17.Transferbuffer(25mMTris-Cl,192mMGlycine,20%methanol)
18.考马斯亮蓝R-250(0.05%考马斯亮蓝R-250,50%甲醇,10%乙酸)
19.Bio-Radprotein111)电泳仪电泳槽、转移槽
20.台式高速冷冻离心机
(一)、SDS-PAGE
1.按电泳仪说明书组装好灌胶模块。
2.按table1配制凝胶溶液,按要求制备分离胶和积层胶,凝固后备用。
3.上样:
调整蛋白质样品浓度为5μg/μl,加入等体积的2×
SDS上样缓冲液,隔水煮沸5mim,冷却后按顺序依次上样(电转移胶每孔上样20μl,银染胶每孔上样8μl,含合适的proteinmarker。
4.电泳:
接通电源,恒压电泳(30mA,1小时,Tris-Glycine电泳缓冲液)至染料前沿到达凝胶底部。
5.凝胶考马斯亮蓝染色:
将凝胶置于盛有考马斯亮蓝染色(10%乙酸,45%甲醇,45%水,0.05%考马斯亮蓝G-250)中,室温染色2小时以上,脱色液(10%乙酸,45%甲醇,45%水)脱色4小时以上至蛋白条带清新为止。
6.凝胶银染略。
Table1
Contens
10%separationgel(ml)
5%condensinggel(ml)
Non-ionwater
4
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