一株沼泽红假单胞菌的分离鉴定及应用研究Word格式文档下载.docx
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VOTO1-G,wasisolatedfromriversedimentmainlyreceiveddomesticwastewater.The
VOTO1-Gbacteriawasresearchedaboutitsgrowthlaw,andidentifiedbymolecular
biologymethod,andfurtherusedtotestitsabilityintheremovingofnitrogen,phosphorus
andorganiccompoundfromeutrophicwaterby0.05‰,0.1‰and0.2‰.ResultsBy
checkingtheindividualmorphology,colonyculturecharacteristics,DNAsequencingand
16SrDNAgenebank,VOTO1-GwasidentifiedasRhodopseudomonaspalustris.The
isolatedbacteriastrainhadsomenitrogen,phosphorusandorganiccompoundremoval
ability.ConclusionOnestrainofphotosyntheticbacteriawassuccessfullyisolatedfrom
sewagesediments.Itsremovalcapacityofnitrogen,phosphorusandorganiccompound
fromeutrophicwaterwasgood,whichremovedCOD12%,TP25%,TN13%.
Keywords:
photosyntheticbacteria,Rhodopseudomonaspalustris,eutrophication,
riversediment,eutrophicwater第6期王琳,等.一株沼泽红假单胞菌VOTO1-G的分离鉴定及应用研究939
近年来,国内外关于光合细菌去除水体中营
养物质的报道很多
[1-5]
,主要集中在发展生物脱
氮除磷的新工艺和新概念
[6-7]
、菌株选育
[8-10]
等方
面。
在菌种的选育方面,虽然已经发现了多种不
同类型的光合细菌,但是不同光合细菌的脱氮除
磷能力不同。
如何获得高效的降解菌株以及如何
使其成为反应体系中的优势种群而发挥更好的脱
氮除磷效果仍然是研究的热点。
本试验从受纳生
活污水的河流沉积物中分离、筛选光合细菌高效
降解菌株,并采用形态学特征、分子生物学等多种
方法进行鉴定,为研究其在富营养化水体中的脱
氮除磷性能和相关污水的处理提供微生物基础。
1材料与方法
1.1富集培养
北京市清河主要是生活污水的受纳水体,氮、
磷含量很高,其中总氮浓度(TN)为9.46mg/L(以
N计),总磷浓度(TP)为0.96mg/L(以P计)。
取
清河的底泥100g装入透明的玻璃圆桶标本缸内,
与1000ml光合细菌液体富集培养基搅拌均匀,然
后在标本缸上层加入液体石蜡以隔绝空气,在
(25~35)℃下,以4000lx光照强度培养2周。
用
无菌滴管从光合细菌生长良好的圆桶玻璃标本缸
内壁处,吸取红色细菌和污水水样5ml,移植到无
菌试剂瓶中,加入灭菌后的富集培养液,加上橡皮
塞,造成厌氧状态,继续光照,厌氧培养时保持
(25~35)℃,试剂瓶中菌液的颜色逐渐变红。
待
生长良好后,再按上述同样步骤转接3次,至试剂
瓶中菌液成棕红色,红螺菌科细菌占优势。
红螺
菌科分离培养基:
NH
4
Cl0.1g,MgCl
2
0.02g,酵母
膏0.01g,K
HPO
0.05g,NaCl0.2g,琼脂2g,蒸馏
水90ml,0.1MPa灭菌20min。
灭菌后,无菌操作
加入经过滤除菌的0.5g/5mlNaHCO
3
;
再无菌加
入过滤除菌的0.1gNa
S·
9H
O;
最后再加5ml
经过除菌的4%丙氨酸。
用过滤灭菌的0.1mol/L
H
PO
调pH至7.0。
红螺菌科富集培养基:
Cl0.1g,NaHCO
(5%NaHCO
水溶液,过滤除菌取2ml加入无菌
培养基中)0.1g,K
0.02g,CH
COONa
0.1g,MgSO
·
7H
O0.02g,NaCl0.05g,生长因子
(维生素B
1
0.001mg、尼克丁酸0.1mg、对氨基苯
甲酸0.1mg、生物素0.001mg,以上药品溶于蒸馏
水中,定容至10ml,然后过滤除菌)1ml,蒸馏水
97ml,微量元素溶液(FeCl
6H
O5mg、CuSO
5H
O0.05mg、H
BO
1mg、MnCl
4H
O0.05mg、
ZnSO
O1mg、Co(NO
)
O0.5mg,以上
药品分别溶于蒸馏水中,并定容至1000ml)1ml,
pH7.0
[11]
。
除NaHCO
、生长因子和微量元素溶
液外,各成分溶解后0.1MPa灭菌20min,然后再
分别加入NaHCO
、生长因子和微量元素溶液。
1.2分离纯化
分离用固体培养基:
在液体培养基中加入
2%的琼脂,其他成分不变。
将已融化并冷却至(45~50)℃红螺菌分离
培养基倾倒平板;
再用已经过过滤除菌的0.05%
抗坏血酸溶液对富集培养的红螺菌科细菌菌悬液
适当稀释;
以涂布分离法将稀释的红螺菌科细菌
菌悬液在平板上,然后再倒入(45~50)℃红螺菌
分离培养基,造成厌氧环境,(25~35)℃,4000lx
光照下培养。
待棕红色菌落出现后,挑单菌落在
2ml液体富集培养基中进行扩增培养。
重复上述
操作,反复进行涂平板挑单菌落,直至获得纯菌
种。
同时保存纯菌种:
(1)液态保存:
将液体培养
基灭菌后接入菌种,经光照培养后,置于4℃冰箱
中,以后每隔30天转接一次;
(2)固态保存:
制备
固体培养基,挑取较大的菌落穿刺接种,经光照培
养后用液体石蜡封口,用黑布包裹后,置于-70℃
下,每隔一年转接一次
[12]
1.3菌种的生长规律试验
在菌种筛选试验的基础上,对获得的菌种进
行细胞生长测定及其生长规律的试验研究。
在光
合细菌的富集培养基中按20%的接种量接种,在
30℃光照培养箱中培养,每天同一时间取3个重
复于波长600nm处,测其吸光度(A值),以便将
菌体培养到对数生长期的初期或在对数生长期到
稳定期之间。
1.4菌种的鉴定
对所筛选到的菌株进行鉴定,通过观察菌落
形态、显微镜下菌体形态观察、革兰染色、16S
rDNA扩增以及DGGE等分子生物学手段相结合
的方法进行了菌株的鉴定等,依照微生物学细菌
分类鉴定实验方法,对获得的菌株进行初步鉴定。
1.5DNA提取及PCR-DGGE技术
1.5.1样品准备和细菌DNA提取取分离纯菌
株的液体培养液于8ml离心管中,8000r/min,
4℃,离心20min,弃上清液,取沉淀,加入0.5ml
DNA提取缓冲液(1mol/LTris-HCl,pH8.0)备
用。
单菌株DNA的提取采用BenzylChloride
方法
[13]
1.5.2PCR扩增PCR扩增采用AmpliTaq
Gold
TM
反应系统(PerkinElmer,AppliedBiosyst-
ems,NJ,USA)。
引物为357F和517R,它们的序940卫生研究第41卷
列分别为5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’,5’-
ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
PCR的反应程序:
95℃10min;
下面的程序进
行25个循环,93℃1min,50℃1min,72℃1min
30s;
之后,93℃1min,50℃1min,72℃5min。
反
应体系(50μl):
1μldNTP(10mmol/L)、5μl10×
PCRGoldBuffer、4μlMgCl
(25mmol/L)、0.5μl
357F(45pmol/μl)、0.5μl517R(45pmol/μl)、1μl
模板DNA(10ng/μl)和0.5μlTaq酶(2U/ml),其
余体积用无菌水补充。
PCR产物以2%琼脂糖凝
胶电泳检测,经纯化后送测序公司测序,所获得的
DNA序列与BLAST程序的数据库序列比较,确
定菌株的分类地位。
1.5.3D
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- 关 键 词:
- 沼泽 红假单胞菌 分离 鉴定 应用 研究