手足口病标本采集及检测技术方案PPT推荐.ppt

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中华人民共和国卫生部于和国卫生部于2008年年5月月2日起，将该病列为日起，将该病列为丙类传染病丙类传染病管理管理。

背景知识病原学引起手足口病（HFMD）的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括：

柯萨奇病毒A组（CoxasckievirusA,CVA）的2、4、5、7、9、10、16型等B组（CoxasckievirusB,CVB）的1、2、3、4、5型等；

肠道病毒71型（HumanEnterovirus71,EV71）；

埃可病毒（Echovirus,ECHO）等。

背景知识病原学其中以EV71和CVA16为主要病原。

近年来我国陆续出现这两种病原引起的HFMD季节性流行，局部呈强流行态势。

由此，HFMD的有关研究日益受到人们的重视。

目前对于HFMD感染尚没有特效的疫苗和药物，主要采用对症和支持治疗，积极防止发生并发症，因此加强疾病及病原的监测、准确处置疫情、开展健康教育是控制的关键。

背景知识国外流行概况手足口病是一种全球性传染病，世界大部分国家和地区均有此病流行的报道。

1957年首先发生于加拿大，并于同年在新西兰被最早加以描述和报告。

1958年加拿大初步查出CVA16病毒为本病病原。

澳大利亚、美国、瑞典是最早出现手足口病的国家之一。

1959年英国伯明翰、美国加利福尼亚地区发生流行，并从患者疱疹液中分离出CVA16，并根据本病病变分布特点，被正式命名为“手足口病”。

国外流行概况1972年EV71病毒引起的手足口病在美国被首次确认，此后EV71感染与CVA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。

日本是手足口病发病较多的国家，历史上发生过多次CVA16，EV71引起的大规模流行。

我国流行概况1981年我国首次在上海市暴发手足口病。

此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海、广东和河南等省市陆续出现该病报道。

1983年天津发生由CVA16引起的手足口病暴发流行，510月间发生病例7000余例，经过两年散发流行后，1986年出现了以托儿所及幼儿园为主的疫情暴发。

1995年武汉病毒研究所从手足口患儿标本中分离到EV71。

1998年深圳市防疫站同样分离到EV71。

我国流行概况1998年我国台湾地区发生EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，检测哨点共报告129106例患者，重症患者405例，死亡78例，多为五岁以下幼儿。

2000年山东省招远市手足口病暴发，市人民医院共接诊患儿1698例，最小年龄5个月，最大14岁，3例合并心肌炎死亡。

2008年安徽阜阳市发生较大规模手足口病疫情，共报告病例6606例，其中23例死亡。

一、采集标本的种类、保存和运输

（二）咽拭子标本（三）血清标本（四）疱疹液（六）尸检标本

（一）粪便标本（七）脑脊液标本（五）肛拭子标本

（一）粪便标本采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。

粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4暂存12小时内送达实验室；

-20以下低温冷冻保藏；

长期保存的标本存于-70冰箱。

一、采集标本的种类、保存和运输

（二）咽拭子标本采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。

用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；

迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。

4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。

一、采集标本的种类、保存和运输（三）血清标本在手足口病流行年份中应采集EV71和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。

采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。

静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。

将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。

一、采集标本的种类、保存和运输（四）疱疹液在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。

先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。

一、采集标本的种类、保存和运输（五）肛拭子标本采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。

用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有35ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。

采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

一、采集标本的种类、保存和运输（六）尸检标本采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。

每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

一、采集标本的种类、保存和运输（七）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。

采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。

采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。

但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。

一、采集标本的种类、保存和运输一、采集标本的种类、保存和运输临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。

依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。

可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。

在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。

在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。

标本种类标本种类采集方法采集方法保存保存运输运输粪便发病3日内的粪便，5-8g/份，立即放入无菌采便管内，贴上带有唯一识别号码的标签。

4暂存12小时内送达实验室；

避免反复冻融。

全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。

按B类包装，尽量缩短运输时间。

可采用陆路或航空等多种运输方式，在运输过程中应采取保护措施。

咽拭子发病3日内的咽拭子，专用采样棉签，拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，避免触及舌部；

迅速将棉签放入装有3-5ml保存液的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，贴上带有唯一识别号码的标签。

血清采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清。

静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，贴上带有唯一识别号码的标签。

-20以下冰箱中冷冻保存。

疱疹液用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，贴上带有唯一识别号码的标签。

标本种类标本种类采集方法采集方法保存保存运输运输肛拭子发病3日内的肛拭子，用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有35ml保存液的15ml外螺旋的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，贴上带有唯一识别号码的标签。

尸检标本脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。

每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，旋紧管盖，贴上带有唯一识别号码的标签。

脑脊液出现神经系统症状的病例，采集出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。

采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，旋紧管盖，贴上带有唯一识别号码的标签。

二、标本采集注意事项用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。

对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。

用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。

为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。

不能立即检测的标本应冷冻保存。

在手足口病的实验室诊断中，在手足口病的实验室诊断中，从从疱疹液疱疹液或或脑脊液脑脊液中分离到病中分离到病毒即可毒即可诊断诊断该病毒为该病毒为病因病因。

标本保存液的配置保存液Eagles液（MEM）80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、链霉素（各10000U/ml）10ml三、实验室检测操作流程

（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）（四）Real-timeRT-PCR（rRT-PCR）

（一）病毒分离

（一）病毒分离2病毒分离细胞系3标本的处理4接种和观察（病毒分离）5病毒分离结果解释1.试剂配置三、实验室检测操作流程

（一）病毒分离1.试剂配置

（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：

生长液生长液（GMGM）维持液（维持液（MMMM）Eagles液（MEM）86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、链霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml三