沈阳药科大学生物化学课件15PPT格式课件下载.ppt
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合成的药物或药物中间体。
微微生生物物转转化化反反应应是是利利用用微微生生物物的的代代谢谢才才作作用用来来进进行行某某些些化化学学反反应应,确确切切地地说说就就是是利利用用微微生生物物代代谢谢过过程程中中某某种种酶酶对对底底物物进进行行催催化化反反应应,以以生生成所需要的活性物质。
成所需要的活性物质。
生物合成技术的另一领域是半合成技术。
氨苄青霉素合成氨苄青霉素合成三、生物技术原理三、生物技术原理生生物物技技术术(botechnologybotechnology)又又称称生生物物工工程程(bioengineering)bioengineering),是是利利用用生生物物有有机机体体(动动物物、植植物物和和微微生生物物)或或其其组组成成部部分分(包包括括器器官官、组组织织、细细胞胞或或细细胞胞器器等等)发发展展新新产产品品或或新新工工艺艺的的一一种种技术体系。
技术体系。
生生物物技技术术一一般般包包括括基基因因工工程程、细细胞胞工工程程、酶酶工工程和发酵工程。
程和发酵工程。
三、生物技术原理三、生物技术原理基基因因工工程程主主要要包包括括基基因因的的分分离离、制制备备、体体外外剪剪切切、重组、扩增、表达与产物的纯化等技术;
重组、扩增、表达与产物的纯化等技术;
细细胞胞工工程程则则包包括括一一切切生生物物类类型型的的基基本本单单位位一一细细胞胞(有有时时也也包包括括器器官官或或组组织织)的的离离体体培培养养、繁繁殖殖、再再生生、融融合合以以及及细细胞胞核核、细细胞胞质质乃乃至至染染色色体体与与细细胞胞器器(如如线线粒粒体、叶绿体等体、叶绿体等)的移植与改建等操作技术;
的移植与改建等操作技术;
酶酶工工程程是是指指酶酶的的工工业业化化生生产产及及其其固固定定化化技技术术以以及及由由酶酶制制剂剂构构成成的的生生物物反反应应器器和和生生物物传传感感器器等等新新技技术术、新装置的研究应用;
新装置的研究应用;
发发酵酵工工程程也也叫叫微微生生物物工工程程,是是在在最最适适条条件件下下,对对单单一菌种进行培养,是生物特定产品的一种生物工艺一菌种进行培养,是生物特定产品的一种生物工艺三、生物技术原理三、生物技术原理现现代代生生物物技技术术的的核核心心内内容容主主要要包包括括重重组组DNA技技术术和单克隆抗体技术。
和单克隆抗体技术。
生生物物工工程程药药物物是是指指运运用用重重组组DNA技技术术和和单单克克隆隆抗抗体体技技术术生生产产的的多多肽肽、蛋蛋白白、激激素素和和酶酶类类药药物物以以及及疫疫苗、单抗和细胞生长因子类药物等苗、单抗和细胞生长因子类药物等重重组组DNA技技术术又又称称基基因因工工程程,其其操操作作过过程程主主要要包包括括:
目目的的基基因因的的获获取取;
基基因因载载体体的的选选择择与与构构建建;
目目的的基基因因与与载载体体的的拼拼接接;
重重组组DNA导导人人受受体体细细胞胞;
筛筛选选并并无无性性繁繁殖殖含含重重组组分分子子的的受受体体细细胞胞(转转化化子子);
工工程程菌菌(或或细细胞胞)的的大大量量培培养养与与目目的的蛋蛋白的生产。
白的生产。
图图15-2由染色体由染色体DNA和和cDNA构建重组构建重组DNA生产目的蛋白示意图生产目的蛋白示意图质粒载体质粒载体A、基因基因DNA(从染色体从染色体DNA中分离中分离)B、cDNA(从从mRNA合成合成)编码目的蛋白的基因编码目的蛋白的基因mRNA逆转录酶从逆转录酶从mRNA合成合成cDNADNA聚合酶聚合酶IdsDNA(双链双链DNA)目的基因目的基因DNA连接酶连接酶限制性内切酶限制性内切酶转化进入宿主细胞转化进入宿主细胞筛选培养克隆筛选培养克隆将筛选的克隆发酵,将筛选的克隆发酵,生产目的蛋白生产目的蛋白重组体质粒重组体质粒宿主宿主DNA图图15-2A、染色体染色体DNA、B、cDNA构建重组构建重组DNA生产目的蛋白示意图生产目的蛋白示意图
(一)基因载体一)基因载体常用的基因载体常用的基因载体(Vector)有质粒、有质粒、噬菌体、噬菌体、M13噬菌体等。
噬菌体等。
逆转录病毒逆转录病毒DNA、昆虫病毒昆虫病毒DNA是将外源基是将外源基因导人动物细胞的载体。
因导人动物细胞的载体。
图图15-3pBR322质粒质粒pBR322oriAmprTerrPstI3609EcoRI4361/0HindIII29BamHI375SalI651AvaI1425PvuII2066
(二)目的基因的来源
(二)目的基因的来源1、直接从染色体直接从染色体DNA分离。
分离。
2、人工合成、人工合成3、从、从mRNA合成合成cDNA4、基因文库基因文库将生物体全部将生物体全部DNADNA提纯,用限制性内切酶随机提纯,用限制性内切酶随机切割成数以万计的片段,所有片段均重组在同切割成数以万计的片段,所有片段均重组在同一类载体上,得到许多重组体,又全部转化人一类载体上,得到许多重组体,又全部转化人宿主菌中保存起来,这就是基因文库。
宿主菌中保存起来,这就是基因文库。
用基因组用基因组(genome)的总的总DNA构建的为构建的为G文库文库用细胞全部用细胞全部mRNA经过反转录制备的经过反转录制备的cDNA后后建库,则称为建库,则称为cDNA文库,文库,(三)限制性内切酶的应用三)限制性内切酶的应用核酸限制性内切酶核酸限制性内切酶(restrictionrestrictionendonucleaseendonuclease)能特异识别核酸分子某些碱基序能特异识别核酸分子某些碱基序列并加以切开列并加以切开其切口类型有两种:
其切口类型有两种:
一种为平端一种为平端(bluntend)bluntend)切口、切口、另一种为粘端切口另一种为粘端切口(stickyend)stickyend),即两链的即两链的切口错开切口错开2244个核苷酸。
个核苷酸。
表表15-1常用的限制性内切酶常用的限制性内切酶酶酶辨认的序列和切口辨认的序列和切口说明说明AluI四核苷酸,平端切口四核苷酸,平端切口AGCTTCGABamHI六核六核苷酸,平端切口苷酸,平端切口GGATCCCCTAGGBglI六核六核苷酸,平端切口苷酸,平端切口AGATCTTGTAGA表表15-1常用的限制性内切酶常用的限制性内切酶酶酶辨认的序列和切口辨认的序列和切口说明说明EcoRI六核六核苷酸,平端切口苷酸,平端切口GAATTCCTTAAGHindIII六核六核苷酸,平端切口苷酸,平端切口AAGCTTTTCGAASalI六核六核苷酸,平端切口苷酸,平端切口GTCGACCAGCTGSmaI六核六核苷酸,平端切口苷酸,平端切口CCCGGGGGGCCC(四)重组体的构建(四)重组体的构建用用同同种种限限制制性性内内切切酶酶切切割割载载体体及及目目的的基基因因后后,无无论论产产生生的的是是平平端端切切口口或或粘粘端端切切口口,都都可可以以用用DNADNA连连接接酶酶把把载载体和目的基因体和目的基因连连接起来,形成接起来,形成DNADNA重重组组体体粘粘端端连连接接方方式式:
如如用用HpaHpa分分别别切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒DNADNA,然然后后混混合合在在一一起起,用用连连接接酶酶作作共共价价连连接接形形成成DNADNA重重组组体,体,这这种方法称种方法称为为粘端粘端连连接方式。
接方式。
还有还有“尾接法尾接法”连接方式。
在载体和目的基因上找不连接方式。
在载体和目的基因上找不到共同的酶切位点时,可先把它们各自的粘端切口用到共同的酶切位点时,可先把它们各自的粘端切口用单链核酸酶切平、在末端核苷酸转移酶作用下,催化单链核酸酶切平、在末端核苷酸转移酶作用下,催化脱氧单核苷酸加于脱氧单核苷酸加于DNA的的3末端,使形成粘端结构。
末端,使形成粘端结构。
如一股如一股DNA加上加上polyC,另一股另一股DNA的的3曰末端加曰末端加polpolyC,因因C-C互补配对,两种互补配对,两种DNA经连接酶处理,也经连接酶处理,也可以形成共价结构的重组体。
可以形成共价结构的重组体。
图图15-4粘端连接方式粘端连接方式CCGGGGCCGGCCCCGGCGGCGGCC哺乳动物哺乳动物DNA片断片断限制性内限制性内切酶切酶HpaIICCGGGGCCCGGCGGCC限制性内限制性内切酶切酶HpaII+混合,退火混合,退火DNA连接酶连接酶CCGGGGCCCCGGGGCC细菌质粒与哺乳动物细菌质粒与哺乳动物DNA片段共同构成的重组质粒片段共同构成的重组质粒(五)重组体的转化五)重组体的转化转化转化(transformatiformation):
重组体如系大肠杆菌质粒,可在重组体如系大肠杆菌质粒,可在0-40-4用用CaCl2CaCl2处理大肠处理大肠杆菌,以增大其细胞膜的通透性,再将杆菌,以增大其细胞膜的通透性,再将CaCl2CaCl2处理过的处理过的受体细菌与重组质粒温育,使质粒透人菌体,将重组受体细菌与重组质粒温育,使质粒透人菌体,将重组DNADNA导人宿主细胞以导人宿主细胞以改变其某些特性,此过程称为转化改变其某些特性,此过程称为转化作用作用转导转导(transductiontransduction):
):
重组体如系噬菌体重组体如系噬菌体DNADNA,可进行体外包装,将其包人入可进行体外包装,将其包人入噬菌体的头部外壳蛋白,并使其含有尾部蛋白,成为有噬菌体的头部外壳蛋白,并使其含有尾部蛋白,成为有侵染力的噬菌体,以导人宿主细胞。
亦可用侵染力的噬菌体,以导人宿主细胞。
亦可用CaCl2CaCl2处理处理宿主细胞,将重组宿主细胞,将重组DNADNA直接引入细胞,以供体直接引入细胞,以供体DNADNA通过噬通过噬菌体导人细胞引起的转化作用称为转导菌体导人细胞引起的转化作用称为转导(transduciontransducion)。
(六)重组体的筛选与鉴定(六)重组体的筛选与鉴定在重组体导人宿主细胞后,经初步扩增后还应在重组体导人宿主细胞后,经初步扩增后还应加以筛选,以获得含目的基因的工程菌加以筛选,以获得含目的基因的工程菌(或细或细胞胞),并鉴定之。
,并鉴定之。
11、根据重组体的表型进行筛选根据重组体的表型进行筛选22、限制酶切图谱分析鉴定、限制酶切图谱分析鉴定33利用核酸杂交技术进行
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