基因工程高三复习用PPT文档格式.ppt
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实质:
基因重组基因重组二、操作的工具二、操作的工具11、基因的基因的“剪刀剪刀”限制性内切酶(限制酶)限制性内切酶(限制酶)特点:
特点:
一种限制酶只一种限制酶只能识别一种能识别一种特定特定的核苷的核苷酸序列,酸序列,并在并在特定特定的切的切点上切割点上切割DNADNA分子。
分子。
-特异性特异性来源:
主要来源于来源:
主要来源于微生物微生物作用部位:
作用部位:
磷酸磷酸二酯键二酯键结果结果:
产生:
产生黏性末端黏性末端或平末端或平末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口,带有几个伸出的单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,他们之间正好互补配核苷酸,他们之间正好互补配对,这样的切口叫对,这样的切口叫黏性末端黏性末端。
平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时,切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时,切开的DNADNA两条单链的切口,是平整的,这样的切口叫两条单链的切口,是平整的,这样的切口叫平末端平末端。
思考思考要要想获得某个特定性状的基因必须要用限想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口?
可产生几个黏性末端?
制酶切几个切口?
要切两个切口,产生四个黏性末端。
如如果把两种来源不同的果把两种来源不同的DNADNA用同一种限用同一种限制酶来切割,会怎样呢?
制酶来切割,会怎样呢?
会会产生相同的黏性末端,然后让两者的黏产生相同的黏性末端,然后让两者的黏性末端黏合起来,就可以合成重组的性末端黏合起来,就可以合成重组的DNADNA分子了。
分子了。
二二、操作的工具操作的工具22、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶(11)作用:
将互补配对的作用:
将互补配对的DNADNA片段连接起来,使片段连接起来,使之成为一个完整的之成为一个完整的DNADNA分子。
(22)作用部位:
形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键(3)常见常见DNA连接酶连接酶EcoliDNA连接酶连接酶(来自大肠杆菌来自大肠杆菌)-只作用于只作用于黏性末端黏性末端。
T4噬菌体连接酶噬菌体连接酶-既连接既连接黏性末端黏性末端又作用于又作用于平末端平末端,但连接平末端的效率较但连接平末端的效率较低低。
连接的部位:
磷酸二酯键(梯子的扶手),连接的部位:
磷酸二酯键(梯子的扶手),不是氢键(梯子的踏板)。
不是氢键(梯子的踏板)。
两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来,DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗?
聚合酶是一回事吗?
T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来,但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用结果作用结果用途用途都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制(4)DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将单个核苷酸连只能将单个核苷酸连接到已有的接到已有的DNADNA片段片段上,形成磷酸二酯键上,形成磷酸二酯键在两个在两个DNADNA片段片段之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二酯键键载体的作用载体的作用载体的必载体的必要条件要条件载体的种类载体的种类3、基因的运输工具基因的运输工具-载体载体11)能够在宿主细胞中)能够在宿主细胞中)能够在宿主细胞中)能够在宿主细胞中复制复制复制复制并稳定地并稳定地并稳定地并稳定地保存保存保存保存。
22)具多个)具多个)具多个)具多个限制酶切点限制酶切点限制酶切点限制酶切点,以,以,以,以便与外源基因连接便与外源基因连接便与外源基因连接便与外源基因连接。
33)具有某些)具有某些)具有某些)具有某些标记基因标记基因标记基因标记基因,便于进行,便于进行,便于进行,便于进行鉴定鉴定鉴定鉴定和和和和选择选择选择选择。
44)必须是)必须是)必须是)必须是安全安全安全安全的的的的,对受体细胞,对受体细胞,对受体细胞,对受体细胞无害无害无害无害。
55)载体)载体)载体)载体DNADNA分子应分子应分子应分子应大小适中大小适中大小适中大小适中,以便于,以便于,以便于,以便于提取和操作提取和操作提取和操作提取和操作11)作为)作为)作为)作为运载工具运载工具运载工具运载工具,将目的基因导入受体细胞中,将目的基因导入受体细胞中,将目的基因导入受体细胞中,将目的基因导入受体细胞中22)在受体细胞内对目的基因进行)在受体细胞内对目的基因进行)在受体细胞内对目的基因进行)在受体细胞内对目的基因进行大量复制大量复制大量复制大量复制细菌的质粒细菌的质粒病毒病毒:
噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体、动植物病毒等。
、动植物病毒等。
有标记基因的存在,有标记基因的存在,可用含青霉素的培可用含青霉素的培养基鉴别养基鉴别。
有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体(即拟核裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体(即拟核DNA)之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状之外,并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子分子。
最常用运载体最常用运载体质粒质粒实际上实际上在基因工程在基因工程操作中,真正被用操作中,真正被用作载体的质粒,都作载体的质粒,都是在天然质粒的基是在天然质粒的基础上进行过人工改础上进行过人工改造的。
造的。
1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目目前被较广泛提取使用前被较广泛提取使用的目的基因有:
苏云金杆的目的基因有:
苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。
基因等。
、提取目的、提取目的基因基因将需将需要的基因从供体生要的基因从供体生物的物的细胞内提取出来。
细胞内提取出来。
供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶(三)基因操作的基本步骤(三)基因操作的基本步骤提取目的基因的方法提取目的基因的方法用限制酶切用限制酶切断成许多片段断成许多片段直接分离基因直接分离基因鸟枪法鸟枪法将供体生物的将供体生物的DNADNA用限制酶用限制酶切割为许多片段,再用运载体将切割为许多片段,再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。
只要有一个细胞获同细胞中去。
只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达,得了需要的目的基因并得以表达,基因工程就算成功了。
基因工程就算成功了。
该法最大的缺点是带有很大该法最大的缺点是带有很大的盲目性,工作量大,成功率低。
的盲目性,工作量大,成功率低。
且不能将真核生物的基因转移到且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。
原核生物中去。
人工合成基因法人工合成基因法DNADNA合成仪合成仪有两种方法:
有两种方法:
逆转录法:
以信使逆转录法:
以信使RNARNA为模板,在逆转录酶为模板,在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合的作用下将脱氧核苷酸合成合成成合成DNA(DNA(基因基因)。
直接合成法:
根据直接合成法:
根据蛋白质的氨基酸顺序推算蛋白质的氨基酸顺序推算出信使出信使RNARNA核苷酸顺序,核苷酸顺序,再据此推算出基因再据此推算出基因DNADNA的的脱氧核苷酸顺序。
用游离脱氧核苷酸顺序。
用游离脱氧核苷酸直接合成相应脱氧核苷酸直接合成相应的基因。
的基因。
(33)从基因文库中提取(常用)从基因文库中提取(常用)基因文库基因文库:
将含有某种生物的不同基因的许多片段,:
将含有某种生物的不同基因的许多片段,导入受体菌(如大肠杆菌)中储存,我们把这些菌群导入受体菌(如大肠杆菌)中储存,我们把这些菌群的总称看做基因文库。
的总称看做基因文库。
基因文库(总称)基因文库(总称)基因组文库:
某种生物的基因组文库:
某种生物的一组遗传信息(全部基因)一组遗传信息(全部基因)cDNA文库文库(44)聚合酶链反应()聚合酶链反应(PCRPCR)扩增)扩增概念概念:
PCRPCR全称为全称为_,是一项,是一项在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段原理原理:
DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)等等模板模板DNADNA(需含有目的基因需含有目的基因)条件:
条件:
一段已知目的基因的核苷酸序列,以便一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成根据这一序列合成引物引物前提:
前提:
TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶等等分分子子生生物物学学2010实实验验PCR仪仪小结:
小结:
提取目的基因提取目的基因(11)直)直接获取目接获取目的基因:
的基因:
如从基因文库提如从基因文库提取,取,“鸟枪鸟枪法法”,PCRPCR扩增。
扩增。
(22)人工合成基因:
)人工合成基因:
化学合成法化学合成法蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA单链单链DNADNA序列序列双链双链DNADNA推测推测合成合成推测推测反转录法反转录法mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链DNADNA逆转录逆转录合成合成22、构建表达载体、构建表达载体用用与提取目的基因与提取目的基因相同的限制酶切割质相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口,粒使之出现一个切口,将目的基因插入切口将目的基因插入切口处处,在,在连拉酶的作用连拉酶的作用下连接形成重组下连接形成重组DNADNA分分子。
子。
一个完整的表达载体一个完整的表达载体包括:
包括:
目的基因目的基因,标标记基因记基因,启动子启动子,终终止子止子。
知识点一:
1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子:
启动子:
位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。
没有启动子,基因就不能转录。
合成的
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- 基因工程 复习
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