第十章酶在食品分析中的应用PPT文档格式.ppt
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n2)催化待测物生成新的产物,而这种产物更容易被定量分析。
如:
淀粉的测定。
n3)测定食品中酶的活性作为食品的指标,如过氧化物酶的测定、蜂蜜中酶的测定。
n4)利用酶催化反应所产生的一些信息。
如酶联免疫法、酶电极法等。
2酶联免疫测定(ELISA)n酶联免疫测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)是继放射免疫测定技术之后发展起来的一项新的免疫学技术。
nELISA自上世纪70年代出现开始,就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点,在临床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视,成为检验中最为广泛应用的方法之一。
2.1ELISA的的基本原理n
(1)利用抗原与抗体的特异反应将待待测测物与酶连接(或建立关联)物与酶连接(或建立关联)。
n
(2)通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。
n它将酶酶促促反反应应的的高高效效率率和免免疫疫反反应应的的高高度度专专一一性性有机地结合起来,可对生物体内各种微量有机物的含量进行测定。
测定的对象可以是抗体也可以是抗原。
重点重点ELISA试剂盒的组成试剂盒的组成n完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:
(1)包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂免疫吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(标记物标记物);
(3)酶作用的底物(显色剂显色剂);
(4)阴性和阳性对照品(定性测定),参考标准品和控制血清(定量测定);
(5)结合物及标本的稀释液;
(6)洗涤液;
(含吐温20磷酸盐缓冲液)(7)酶反应终止液。
(常用硫酸)必需必需酶标仪和酶标板酶标仪和酶标板DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪酶标板酶标板2.2ELISA2.2ELISA的基本类型的基本类型n随着ELISA在生物检测分析领域的广泛应用,根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,逐渐演变出了几种不同类型的检测方法:
(5)捕获法测IgM抗体;
(6)ABS-ELISA法;
(7)PCR-酶联免疫测定法;
(8)斑点免疫酶结合试验。
(1)夹心法;
)夹心法;
(2)间接法;
)间接法;
(3)竞争法;
)竞争法;
(4)双位点一步法;
双抗体夹心法n此此法法常常用用于于测测定定抗抗原原,将将已已知知抗抗体体吸吸附附于于固固相相载载体体,加加入入待待检检标标本本(含含相相应应抗抗原原)与与之之结结合合。
温育后洗涤,加入酶标抗体和底物进行测定。
(1)双抗体夹心法)双抗体夹心法乙肝表面抗原。
间接法n此此法法是是测测定定抗抗体体最最常常用用的的方方法法。
将将已已知知抗抗原原吸吸附附于于固固相相载载体体,加加入入待待检检标标本本(含含相相应应抗抗体体)与与之之结结合合。
洗洗涤涤后后,加加入入酶酶标标抗抗球球蛋蛋白白抗抗体体(酶酶标抗抗体标抗抗体)和底物进行测定。
和底物进行测定。
(2)间接法)间接法ELISA竞争法n此此法法可可用用于于抗抗原原和和半半抗抗原原的的定定量量测测定定,也也可可用用于于测测定定抗抗体体。
以以测测定定抗抗原原为为例例,将将抗抗原原吸吸附附于于固固相相载载体体;
加加入入待待测测抗抗原原和和一一定定量量特特异异性性抗抗体体,使使固固相相抗抗原原与与待待测测抗抗原原二二者者竞竞争争与与抗抗体体结结合合;
经经过过洗洗涤涤分分离离,最最后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。
后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。
(3)竞争法)竞争法黄曲霉素2.3ELISA测定中酶的作用测定中酶的作用n由于酶的催化效率很高,间接地放放大大了免疫反应的结果,使测定具有极高的灵敏度。
(1)酶标记的抗体或抗原的制备)酶标记的抗体或抗原的制备n酶标记的抗体或抗原是ELISA中最关键的试剂。
良好的结合物既保持了酶的催化活性,也保持了抗体或抗原的免疫活性。
n酶标记抗体的制备主要有戊戊二二醛醛交交联联法法和过过碘碘酸酸盐盐氧氧化化法法两种方法。
酶结合物一般需经离子交换层析或分子筛分离纯化。
(2)常用的酶及底物)常用的酶及底物酶酶底底物物显色反应显色反应测定波长测定波长辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并噻唑啉磺酸并噻唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-AS-MxMx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐黄色黄色红色红色400400500500葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰黄色黄色蓝色蓝色405405420420-半乳糖苷酶半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色360,450360,450420420为什么辣根过氧化物酶可应用于为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa?
为什么辣根过氧化物酶可应用于为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa?
n
(1)成本低n
(2)热稳定性好n(3)显色反应类型多2.4ELISA技术在食品分析中的应用技术在食品分析中的应用n近年来,ELISA因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性,在农药残留、兽药残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人畜共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域正逐步推广应用。
(1)毒素检测n真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物,其中的十几种对人类危害较大,它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。
其中毒性最大、致致癌癌能能力力最最强强的是黄曲霉毒素。
它在自然界中分布十分广泛,黄曲霉常常和其他多种微生物在一起,生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。
n自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世至今,几乎所有重要真菌毒素如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA检测方法均已建立。
n在对黄曲霉素B1(AFTB1)的检测中,其检测AFTB1的线性范围0.255.Og/mL,灵敏度为12.5Pg,整个测定过程仅为4h。
另外该方法也正在被广泛地应用于各种藻类和贝类毒素的检测。
黄曲霉素B1ELISA试剂盒n本试剂盒包括用于定量检测黄曲霉素B-G的试剂和方法。
n检测数量:
96孔(包括标准)n检测时间:
20分钟金黄色葡萄球菌肠毒素的检测金黄色葡萄球菌肠毒素的检测n蘑菇罐头约占我国罐头出口量的30,中国蘑菇罐头一度占据美国市场2/3份额,1989年以来FDA以我国蘑菇罐头食品含有金黄色葡萄球菌肠毒素并导致消费者伤害为由,对中国蘑菇罐头采取”自动扣留措施”。
2002年才得以解决。
nFDA检测蘑菇罐头葡萄球菌肠毒素使用的TECRA试剂盒在检测过程中会产生强烈的非特异反应,因此,这种试剂盒是不可靠的,其所得出的检测结果也是不可靠的。
(2)农药残留检测n酶联免疫测定已成为许多国际权威分析机构如AOAC分析农药残留的首选方法。
迄今为止,应用酶联免疫测定检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。
草甘膦的ELISA检出下限为0.07g/mL,与色谱法测定的结果一致。
n从目前来看,尽管ELISA检测限度还不能完全达到国外发达国家技术法规和限量标准的要求,而且抗体制备不易和不能同时完成多种农药残留检测等缺点,但是由于该技术具有样本前处理简单,纯化步骤少,大量样本分析时间短,适适合合于于做做成成试试剂剂盒盒现现场场筛筛选选等优点,使其可在蔬菜产区、蔬菜批发市场和海关配备,工商人员可随身携带或建立固定的农药残留速测点,随时把残毒超标的蔬菜、水果杜绝在食用之前。
(3)细菌污染检测n食品中的有害细菌数量达到一定数目,食用后会引起各种疾病。
为了有效地控制其传播,就必须有快速和可靠的检测方法。
目前有许多种方法,其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的酶联免疫测定技术研究最多,检测结果准确可靠。
沙门氏菌的沙门氏菌的ELISA检测n例如对沙门氏菌最低检测量可达500CFU/g,仅需22h,比常规方法缩短了34d,与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
此外以ELISA技技术术为为基基础础的的全全自自动动沙沙门门氏氏菌菌检检测测系系统统,实实现现了了整整个个过过程程的的自自动动化化,全全程程耗耗时时仅仅为为45min。
其原理是将捕捉抗体包被到凹形金属片的内面,可以从前增菌液中吸附被检的沙门氏菌,对于该系统来说,需要做的只是加样。
李斯特氏菌的快速检测李斯特氏菌的快速检测n在对李斯特氏菌的快速检测中,利用三株针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的单抗,以夹心ELISA法,在48h内,可从人工模拟肉中检测下限为5CFU/g样品。
(4)肉类品质检测)肉类品质检测nELISA在肉类食品品质检测中的应用主要包括加热终温判定分析和掺入异种肉的检测两个方面。
肠道疾病的爆发和动物性食品有很大关系,而肉食品加热煮制不当是引起该疾病爆发的一个主要原因。
在加热过程中一些成分的含量会降低,而一些产物的浓度会提高。
n当用蛋白质做指示剂时,可制备抗体,这种抗体对单一蛋白质的天然状态或变性状态均具有专一性,这样它就可以指示蛋白质在加热过程中变化。
因而ELISA可作为商业上快速判定分析肉品终温的一种方法。
目目前前用用的的最最多多的的是是对对乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶的的免免疫疫检检测测。
其次是对掺入异种肉的检测,利用多克隆抗体对血清白蛋白的酶联免疫测定法,对鲜肉进行掺假检测。
n几种以单克隆抗体为基础的ELISA反应已得到应用,可以检测出1%2%的掺假率。
目前在商业上,酶联免疫测定已可以检测十多种动物肉,该方法已为美国农业部使用。
同时,ELISA技术也可以利用对热稳定的肌肉抗原来检测加热处理后的肉掺假情况。
目前,该技术可以检测6种家畜熟肉制品。
(5)动物性食品中药物残留检测n利用ELISA技术测定动物性食品中有害残留成分只是近几年的事。
随着研究的深入,由原样品的复杂处理和抽提发展为只需要高度纯化过程,加速了其在实际检测中的应用。
特别是对猪肉、禽肉和水产品中重要禁用兽药的检测。
n如瘦肉精(盐酸克伦特罗)酶联免疫检测法,基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定,不仅可作为一个定性筛选过程,也可以进一步进行定量测定。
检测灵敏度可达到0.510-9,完全达到我国农业部
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- 第十 食品 分析 中的 应用