微生物优良菌种的选育PPT推荐.ppt
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产泡沫少,适宜大罐生产。
(培养条件要求低,周期短,需氧量小,抗污染能力强)(培养条件要求低,周期短,需氧量小,抗污染能力强)一、自然选育(一、自然选育(spontaneousMutation)概念概念:
不经人工处理,利用微生物自然突变进行的:
不经人工处理,利用微生物自然突变进行的菌种选育的过程。
菌种选育的过程。
自然突变的原因自然突变的原因:
多因素低剂量的诱变效应;
互变异构效应互变异构效应结果结果:
负变大于正变,应经常分离纯化:
负变大于正变,应经常分离纯化l优点:
优点:
简单易行,可与生产同步进行。
l缺点:
缺点:
频率低,频率低,10-810-9/次分裂。
次分裂。
自发突变的原因有三个层次:
细胞外的原因自发突变的原因有三个层次:
细胞外的原因(如紫外线、环境的化学突变剂如紫外线、环境的化学突变剂等等);
细胞内的原因;
细胞内的原因(代谢产生的突变因子,如亚硝酸、过氧化物等代谢产生的突变因子,如亚硝酸、过氧化物等);
DNA分子内的原因分子内的原因(碱基的互变异构效应碱基的互变异构效应)。
1、自然选育的内容和作用对工业生产而言,自发突变的结果有两种:
菌对工业生产而言,自发突变的结果有两种:
菌种衰退种衰退(概率大概率大)和菌种性能的提高和菌种性能的提高(概率小概率小)。
定向培育定向培育(菌种驯化菌种驯化)l利用微生物的自发突变,在特定的培养条件下或环利用微生物的自发突变,在特定的培养条件下或环境中培养微生物,筛选具有特殊性能的微生物的过境中培养微生物,筛选具有特殊性能的微生物的过程。
程。
l卡介苗卡介苗(BCGvaccine)(230代,前后经历代,前后经历13年时年时间)间)、巴斯德定向选育炭疽杆菌疫苗。
巴斯德定向选育炭疽杆菌疫苗。
l用特定的工业废水驯化微生物得到能够处理这种废用特定的工业废水驯化微生物得到能够处理这种废水的菌种。
水的菌种。
二、诱变选育二、诱变选育诱导微生物发生突变进行的菌种选育,包括诱导微生物发生突变进行的菌种选育,包括诱变诱变和和筛选筛选两个步骤。
两个步骤。
概念概念:
利用被称为诱变剂的物理因素或化学试剂处:
利用被称为诱变剂的物理因素或化学试剂处理微生物细胞,提高其基因突变频率,再通过适当理微生物细胞,提高其基因突变频率,再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
原理原理:
在诱变剂的作用下会出现染色体畸变(染色:
在诱变剂的作用下会出现染色体畸变(染色体或体或DNA片段发生缺失、易位、重复等);
基因突片段发生缺失、易位、重复等);
基因突变变(少数碱基改变少数碱基改变)。
影响诱变的因素:
出发菌株(有一定生产能力,形态、生理强壮)出发菌株(有一定生产能力,形态、生理强壮);
诱变剂的种类(单一或复合)与剂量(不宜过高和过诱变剂的种类(单一或复合)与剂量(不宜过高和过低,致死率:
低,致死率:
70-80)。
)。
诱变剂:
能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。
筛选比诱变更重要。
筛选的方法:
通过选择筛选的方法:
通过选择/鉴别培养基加以识别。
鉴别培养基加以识别。
初筛初筛复筛复筛确定最佳发酵条件(负变多,正变少)确定最佳发酵条件(负变多,正变少)1、诱变选育的基本步骤1、诱变选育的基本步骤选择出发菌株选择出发菌株l具有特定生产性状的能力或潜力;
具有特定生产性状的能力或潜力;
l形态、生理强壮,产量较高;
形态、生理强壮,产量较高;
l对诱变剂的敏感性大;
对诱变剂的敏感性大;
l变异幅度大。
变异幅度大。
制备菌悬液制备菌悬液l尽可能均匀,避免因多细胞聚集造成诱变尽可能均匀,避免因多细胞聚集造成诱变筛选得到的菌落不纯。
筛选得到的菌落不纯。
本身性本身性能要好能要好易经诱易经诱变提高变提高诱变剂及剂量的选择诱变剂及剂量的选择l可以选择单一诱变剂,也可以选择可以选择单一诱变剂,也可以选择复合诱变剂复合诱变剂。
l常见的诱变剂包括:
常见的诱变剂包括:
l物理诱变剂,如紫外线、射线、物理诱变剂,如紫外线、射线、射线、激光、快中子射线、激光、快中子等。
等。
l化学诱变剂,如化学诱变剂,如硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯、甲基磺酸乙酯(EMS)、N甲基甲基-N-N-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)、氮芥、乙烯亚胺等(、氮芥、乙烯亚胺等(烷烷化剂化剂(alkylatingagent)),又如亚硝酸等(),又如亚硝酸等(使碱基氧化脱使碱基氧化脱氨基,氨基,AtoH,CtoU,GtoX),又如),又如5-溴尿嘧啶、溴尿嘧啶、5-氟氟尿嘧啶、尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等(氮鸟嘌呤等(碱基类似物碱基类似物)。
l复合诱变剂复合诱变剂l使用两种或数种诱变剂处理生产菌种,联合使用两种或数种诱变剂处理生产菌种,联合使用的两种或多种诱变剂称为复合诱变剂。
使用的两种或多种诱变剂称为复合诱变剂。
l增变因子:
单独使用无诱变作用,但和诱变增变因子:
单独使用无诱变作用,但和诱变剂共同使用可以提高诱变效果乃至正突变频剂共同使用可以提高诱变效果乃至正突变频率的物理或化学因素。
率的物理或化学因素。
l诱变剂量的表示方法诱变剂量的表示方法l可以直接用所使用的诱变剂的单位表示,如可以直接用所使用的诱变剂的单位表示,如紫外线的强度、化学诱变剂的浓度和处理时紫外线的强度、化学诱变剂的浓度和处理时间等。
间等。
l也可以用致死率表示也可以用致死率表示。
l诱变剂量的选择通常以致死率为依据,但须诱变剂量的选择通常以致死率为依据,但须根据具体条件摸索。
根据具体条件摸索。
变异菌株的筛选方案变异菌株的筛选方案l根据菌落的形态变化筛选根据菌落的形态变化筛选l根据特定产物的合成机理或菌种特性筛选根据特定产物的合成机理或菌种特性筛选l抗代谢类似物抗代谢类似物l营养缺陷型营养缺陷型l抗生素抗性菌株抗生素抗性菌株l初筛(筛选的菌株多,不需要很精确)初筛(筛选的菌株多,不需要很精确)l复筛(筛选的菌株少,需要很精确)复筛(筛选的菌株少,需要很精确)l用与生产条件相似的培养基培养突变株,对用与生产条件相似的培养基培养突变株,对突变株的生产能力进行验证。
突变株的生产能力进行验证。
2、突变菌株的筛选筛选的重点筛选的重点在初筛在初筛(前面前面两点两点),因为,因为复筛的工作复筛的工作量小。
量小。
2.1、营养缺陷型突变株筛选、营养缺陷型突变株筛选野生型菌株:
从自然界分离得到的微生物发生突变前的原始菌株,为野生型菌株(wildtypestrain)。
营养缺陷型:
野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养(氨基酸,维生素,核酸等)的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长,成为营养缺陷型(auxotroph)。
基本培养基:
仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基,成为基本培养基(minimalmedium,MM),有时用符号“”来表示。
不同微生物的基本培养基是不相同的。
完全培养基:
凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基,成为完全培养基(completemedium,CM),有时用符号“+”表示。
完全培养基营养丰富,全面,一般可在基本培养基中加入富含氨基酸,维生素和碱基之类的天然物质配制而成。
2.1、营养缺陷型突变株筛选、营养缺陷型突变株筛选酶缺陷,结果造成中间产物积累;
酶缺陷,结果造成中间产物积累;
解除协同反馈,使另一分支末端产物积累;
渗漏型突变(酶未完全丧失活性,下降),末渗漏型突变(酶未完全丧失活性,下降),末端产物少,中间产物积累。
端产物少,中间产物积累。
方法?
可使用影印平板法进行筛选。
完全培养基上长的菌落影可使用影印平板法进行筛选。
完全培养基上长的菌落影印到基本培养基上,不长的为营养缺陷型。
印到基本培养基上,不长的为营养缺陷型。
2.2、抗反馈阻遏和抗反馈抑制、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选突变株筛选调节基因或操纵基因突变,产生的阻遏蛋白调节基因或操纵基因突变,产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合但不发生作用;
与终产物不能结合或结合但不发生作用;
方法方法:
末端产物结构类似物筛选;
(未突变者死)末端产物结构类似物筛选;
(未突变者死)2.3、组成型突变株筛选、组成型突变株筛选诱导型依赖诱导物。
组成型不依赖诱导物。
诱导型依赖诱导物。
突变发生在调节基因或操纵基因突变发生在调节基因或操纵基因,解除对解除对诱导物的依赖诱导物的依赖,可获组成型突变株。
可获组成型突变株。
筛选方法:
设计条件使组成型优势生长,筛选方法:
设计条件使组成型优势生长,或通过适当方法分辨组成型菌落。
或通过适当方法分辨组成型菌落。
筛选方法筛选方法加诱导酶合成抑制物加诱导酶合成抑制物如:
加邻硝基如:
加邻硝基-D-岩藻糖苷,抑制岩藻糖苷,抑制-半乳糖苷酶合成。
半乳糖苷酶合成。
诱导型不能利用乳糖,不长;
组成型产酶,能利用乳糖,诱导型不能利用乳糖,不长;
组成型产酶,能利用乳糖,生长,被富集。
生长,被富集。
交替培养法交替培养法含诱导物(乳糖)中培养含诱导物(乳糖)中培养组成型快组成型快不含诱导不含诱导物(葡萄糖)中培养物(葡萄糖)中培养诱导型失酶诱导型失酶反复。
反复。
显色反应法显色反应法不含诱导物平板培养不含诱导物平板培养加底物加底物分解(有颜色变分解(有颜色变化)化)检出。
检出。
2.4、抗(敏感)性突变株筛选、抗(敏感)性突变株筛选包括:
抗生素、金属离子、温度、噬菌体包括:
抗生素、金属离子、温度、噬菌体抗生素抗性突变:
抗生素抗性突变:
提高产量;
抗噬菌体突变:
消除噬菌体污染;
条件抗性突变:
也称条件致死突变,如温度也称条件致死突变,如温度温度敏感突变,乳糖短杆菌(谷氨酸产生菌)高温温度敏感突变,乳糖短杆菌(谷氨酸产生菌)高温呈营养缺陷表型,在富含生物素的培养基中高温培养,呈营养缺陷表型,在富含生物素的培养基中高温培养,提高产量;
物敏突变物敏突变(柠檬酸转化异柠檬酸)(柠檬酸转化异柠檬酸)如:
氟乙酸抑制顺乌头酸酶,氟乙酸敏感突变型,如:
氟乙酸抑制顺乌头酸酶,氟乙酸敏感突变型,柠檬酸积累。
柠檬酸积累。
三、三、杂交育种杂交育种工业上长期诱变会使菌种工业上长期诱变会使菌种生活能力生
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- 微生物 优良 菌种 选育