蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用PPT推荐.ppt
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n对应于基因组的所有蛋白质构成的对应于基因组的所有蛋白质构成的整整体体,不是局限于一个或几个蛋白质。
,不是局限于一个或几个蛋白质。
n同一基因组在不同细胞、不同组织中同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同的表达情况各不相同。
n在空间和时间上在空间和时间上动态变化动态变化着的整体。
着的整体。
蛋白质组是:
蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics)指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学,新兴科学,其目的其目的是从整体的角度分析细胞是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
蛋白质组学研究的内容蛋白质组学研究的内容蛋白质表达模式蛋白质表达模式(或蛋白质组组成或蛋白质组组成)的研究的研究蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与基因组学相对应的主要内容。
它要求对蛋白质组进行基因组学相对应的主要内容。
它要求对蛋白质组进行表征表征,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。
即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。
双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-(2-D)和质谱和质谱(Massspectrometry)技技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术蛋白质组功能模式蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系质相互作用网络关系)的研究的研究大规模的蛋白质分析过程大规模的蛋白质分析过程n样品制备样品制备n是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。
是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。
n蛋白质分离(技术):
蛋白质分离(技术):
n二维电泳(核心技术)、多维色谱二维电泳(核心技术)、多维色谱n蛋白质分析与鉴定(技术):
蛋白质分析与鉴定(技术):
n质谱技术(核心技术)、蛋白质芯片技术、酵质谱技术(核心技术)、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术等。
母双杂交技术和噬菌体表面展示技术等。
蛋白质组发展的蛋白质组发展的瓶颈瓶颈是缺乏自动化的蛋白是缺乏自动化的蛋白质分析的完整途径。
质分析的完整途径。
第二节第二节蛋白质组学研究基本技术蛋白质组学研究基本技术n典型的蛋白质组学研究常分为四个步骤:
型的蛋白质组学研究常分为四个步骤:
从生物学物质(如细胞、组织、体液等)从生物学物质(如细胞、组织、体液等)提取蛋白质混合液提取蛋白质混合液分离蛋白质混合液分离蛋白质混合液将有意义的蛋白质消化将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析成肽进行质谱分析将质谱获得的数据利用各种将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析生物信息学工具进行分析n蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴定和解析蛋白质技术的进步。
定和解析蛋白质技术的进步。
n重要技术突破主要包括三点:
重要技术突破主要包括三点:
n固相化固相化PH梯度二维电泳(梯度二维电泳(IPG-2-DE)的的发明与完善;
发明与完善;
n生物质谱生物质谱,即应用软电离技术对生物大分,即应用软电离技术对生物大分子进行分析的质谱技术的发展;
子进行分析的质谱技术的发展;
n生物信息学生物信息学发展。
发展。
一、蛋白质组研究中的蛋白质分离
(一)、二维(双向)凝胶电泳
(一)、二维(双向)凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis,2-DE):
利用蛋白质的等电点和分子量,结合凝胶利用蛋白质的等电点和分子量,结合凝胶化学特性,分离各种蛋白质的方法。
化学特性,分离各种蛋白质的方法。
原原理理第第一一向向在在高高压压电电场场下下对对蛋蛋白白质质进进行行等等电电聚聚焦焦电电泳泳技技术术(IEF)将将蛋蛋白白质质混混合合物物按按照照等等电电点点高高低低进进行行分分离离,再再在在第第一一向向垂垂直直方方向向上上进进行行第第二二向向SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(SDS-PAGE)按按照照相相对对分分子子质质量量大大小小进进行行蛋蛋白白质质分离。
分离。
1975年首先由年首先由OFarrell等创立。
等创立。
特特点点n可分离可分离10100kD分子量的蛋白分子量的蛋白质质n高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率n便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理n与质谱分析匹配与质谱分析匹配第一向第一向IEF电泳电泳n传统传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。
系统双向电泳的缺陷。
npH凝胶制作的不稳定和重复性差限制了凝胶制作的不稳定和重复性差限制了等点聚焦电泳技术的应用,等点聚焦电泳技术的应用,nBjellgvist等发展并完善了固相等发展并完善了固相pH梯梯度等电聚焦技术,度等电聚焦技术,Grg等成功地将之等成功地将之应用于双向电泳应用于双向电泳。
优点优点固相固相pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。
稳定的可以随意精确设定的稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
梯度。
尤尤其其可可在在较较窄窄的的pH范范围围内内进进行行第第二二轮轮分析,大大提高了分辨率及重复性。
分析,大大提高了分辨率及重复性。
第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳垂直板电泳垂直板电泳水平超薄胶电泳水平超薄胶电泳双向电泳典型过程包括:
双向电泳典型过程包括:
n蛋白质样品制备:
蛋白质样品制备:
要防止蛋白质酶降解蛋白质。
n上样上样n一种是一种是IPGIPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上样。
样。
n别一种是将样品与重泡胀液混合,在别一种是将样品与重泡胀液混合,在IPGIPG胶条泡胀的同时胶条泡胀的同时样品出参入了胶条。
样品出参入了胶条。
nIPGIPG的运行和平衡的运行和平衡nSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n胶上蛋白质检测和定量:
胶上蛋白质检测和定量:
n荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿,线性范围要远高荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿,线性范围要远高地银染,与质谱兼容性好。
地银染,与质谱兼容性好。
n图像采集、分析及数据处理图像采集、分析及数据处理2-DE技术的缺点技术的缺点所所能能分分离离的的蛋蛋白白质质的的性性质质有有一一定定限限制制,如如蛋蛋白白质质分分离离范范围围一一般般为为8200kD,对对极极碱碱性性蛋蛋白白质质,疏疏水水性性蛋蛋白白质质,包包含含信信号号蛋蛋白白和和转转录录因因子子的的低低丰丰度度蛋蛋白白质质难难于于有效分离。
有效分离。
在在2D胶胶上上有有些些蛋蛋白白质质点点量量太太少少,难难以以进进行行质质谱谱鉴鉴定定;
操操作作费费时时、费费力力,自自动动化化程程度度低低难于与质谱联用实现自动化性质联用。
难于与质谱联用实现自动化性质联用。
2、新型非凝胶技术、新型非凝胶技术高效液相色谱法高效液相色谱法Highperformanceliquidchromatography,HPLC毛细管电泳毛细管电泳capillaryelectrophoresis,CE液相等点聚焦和毛细管色谱液相等点聚焦和毛细管色谱capillaryelectrochromatography特点:
特点:
自动化程度高、分辨率高,检测限低。
采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究的基本路线的基本路线n在非凝胶分离技术中,高效液相色谱由于其分离在非凝胶分离技术中,高效液相色谱由于其分离原理多样,易于组合多维分离模式和与质谱直接原理多样,易于组合多维分离模式和与质谱直接联用而获得了广泛的研究和应用。
联用而获得了广泛的研究和应用。
n高效液相色谱的原理:
高效液相色谱的原理:
溶于流动相中各组分经过溶于流动相中各组分经过固定相时,与固定相发生相互作用,由于相互作固定相时,与固定相发生相互作用,由于相互作用大小、强弱的不同,各组分在固定相中滞留的用大小、强弱的不同,各组分在固定相中滞留的时间不同,由此从固定相中流出的先后也不同,时间不同,由此从固定相中流出的先后也不同,最终使不同组成成分得到分离。
最终使不同组成成分得到分离。
n经典的高效液相色谱系统经典的高效液相色谱系统由输液系统、进样系统、由输液系统、进样系统、分离系统和检测系统构成。
质谱起到了检测器的分离系统和检测系统构成。
质谱起到了检测器的作用。
作用。
n液质联用技术液质联用技术(LC-MS/MSLC-MS/MS)蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替代替2-DE的分离,然后进入的分离,然后进入MS系统获得肽系统获得肽段分子量,再通过串联段分子量,再通过串联MS技术,得到部分技术,得到部分序列信息,最后通过计算机联网查询、鉴定序列信息,最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。
蛋白质。
根根据据蛋蛋白白质质带带电电性性及及疏疏水水性性不不同同,用用MS分离多肽复合物。
分离多肽复合物。
n多维多维色谱技术(色谱技术(LC/LC-MS/MS)n多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology)从从色谱柱中流出有多肽直接进入质谱分析进色谱柱中流出有多肽直接进入质谱分析进行蛋白质鉴定。
行蛋白质鉴定。
二、生物质谱与蛋白质鉴定二、生物质谱与蛋白质鉴定
(一)、基本原理
(一)、基本原理n质谱技术的质谱技术的基本原理基本原理:
样品分子离子化后,:
样品分子离子化后,根据离子间质荷比(根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离)的差异来分离并确定样品的分子量。
并确定样品的分子量。
n个完整的质谱分析仪由个完整的质谱分析仪由进样系统、进样系统、离子化离子化源、质量分析器、源、质量分析器、离子检测器和数据分析离子检测器和数据分析系统系统5个部分组成个部分组成四极杆质谱(四极杆质谱(quadrupole,Q)、)、离子阱质谱(离子阱质谱(iontrap,IT)n飞行时间质谱飞行时间质谱(timeofflight,TOF)n傅里叶变换离子回旋共振质谱(傅里叶变换离子回旋共振质谱(fouriertransformcyclotronresonance,FTICR)常用的质谱分析技术常用的质谱分析技术n电喷雾离子化(电喷雾离子化(electrosprayionization,ESI)和基质辅助
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- 蛋白质 及其 微生物学 研究 中的 应用