生物化学与检验7PPT课件下载推荐.ppt

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的应用。

33、了解了解KmKm值、值、VmaxVmax值的应用及值的应用及KmKm和和VmaxVmax的测定；

同工酶测定和酶活性的测定；

同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。

测定最适条件的选择。

第一节第一节酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识n酶活性的概念酶活性的概念n酶活性单位酶活性单位n酶活性单位的计算酶活性单位的计算n酶促反应进程酶促反应进程n酶促反应底物动力学酶促反应底物动力学一、酶活性的概念一、酶活性的概念酶活性酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。

间内底物的减少量或产物的生成量。

底物浓度为底物浓度为SS,产物浓度为产物浓度为PP,时间为时间为tt，反应速度为，反应速度为vvv=-dS/dt或或v=dP/dt。

注：

在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的注：

在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。

生成量为好。

二、酶活性单位二、酶活性单位n定义：

定义：

指在一定条件下使酶促反应达到某一速度指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。

酶活性单位是一个人为规定的标时所需要的酶量。

酶活性单位是一个人为规定的标准。

准。

惯用单位惯用单位：

酶活性测定方法的建立者所规定的单位。

国际单位国际单位：

1IU指在规定条件（最适指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，最适底物浓度）下，每分钟转化每分钟转化1mol底物的酶量。

单位为底物的酶量。

单位为IU/L。

Katal单位单位：

1Katal指在规定条件下，每秒钟转化指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的底物的酶量，酶量，1Katal=60106IU。

三、酶活性单位的计算三、酶活性单位的计算n步骤：

步骤：

运用公式进行计算。

明确测定方法的明确测定方法的酶单位定义酶单位定义，按照酶单位，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，定义确定物质量、体积和时间的单位，n计算公式计算公式:

产物的增加量产物的增加量每单位规定的保温时间每单位规定的保温时间10001000（mlml）酶单位酶单位/升升=每单位规定的产物增加量每单位规定的产物增加量实际保温时间实际保温时间实际标本用量（实际标本用量（mlml）分光光度法测定的公式：

分光光度法测定的公式：

（AA测定测定AA对照）对照）VV总总101066每单位规定的保温时每单位规定的保温时间间酶单位酶单位/升升=LVLV标标实际保温时间实际保温时间四、酶促反应进程四、酶促反应进程n酶促反应进程曲线酶促反应进程曲线n酶量的测定：

酶量的测定：

通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（确测定酶量，应使酶浓度（EE）与酶促反应速度）与酶促反应速度成正比，即成正比，即EE-ddSS/dt/dt或或EEddPP/dt/dt。

能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。

度，即酶促反应初速度。

酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。

应速度才能准确代表酶活性。

酶的含量酶的含量酶活性酶活性酶促反应初速度酶促反应初速度五、酶促反应底物动力学五、酶促反应底物动力学n中间产物学说：

中间产物学说：

酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。

化底物反应生成产物。

E+SESE+Pn米米-曼氏方程：

曼氏方程：

VmaxSv=S+Km上式中上式中vv代表反应速度，代表反应速度，VmaxVmax代表最大反应速度，代表最大反应速度，SS代表底物浓度，代表底物浓度，KmKm称为米氏常数。

称为米氏常数。

（一）米氏常数的定义

（一）米氏常数的定义由米由米-曼氏方程可以导出：

曼氏方程可以导出：

（Vmax-v）SKm=v当当v=1/2Vmaxv=1/2Vmax时，时，Km=Km=SS。

因此。

因此KmKm值为反应速度相当于值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。

最大反应速度一半时的底物浓度。

KmKm值是酶的特征常数值是酶的特征常数，具有重，具有重要的应用价值。

要的应用价值。

（二）

（二）Km值的应用值的应用1.鉴定酶的种类鉴定酶的种类Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。

酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。

不同种不同种类的酶其类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其条件下测定其Km值加以鉴定。

值加以鉴定。

表表7-17-1某些酶的某些酶的KmKm值值酶酶底物底物Km（mmol/L）乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶丙酮酸丙酮酸0.017己糖激酶己糖激酶D-葡萄糖葡萄糖0.05D-果糖果糖1.5-半乳糖苷酶半乳糖苷酶D-乳糖乳糖4.0碳酸酐酶碳酸酐酶H2CO39.0过氧化氢酶过氧化氢酶H2O225蔗糖酶蔗糖酶蔗糖蔗糖28糜蛋白酶糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸1082.2.反映酶与底物的亲合力反映酶与底物的亲合力KmKm值越大，酶与底物亲合力越小，值越大，酶与底物亲合力越小，KmKm值越小，酶与底物亲合力越大。

值越小，酶与底物亲合力越大。

3.3.选择酶的最适底物选择酶的最适底物KmKm值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的物有不同的KmKm值。

酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，值。

酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。

使酶促反应容易进行，并节省底物用量。

4.4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率大反应速度的比率根据米根据米-曼氏方程可以计算曼氏方程可以计算5.5.设计适宜的底物浓度设计适宜的底物浓度酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的活性，一般要求初速度达到最大速度的90%90%95%95%、底物、底物消耗率为消耗率为1%1%5%5%。

这样既可以近似地表示酶活性，又不。

这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。

致于使底物浓度过高而造成浪费。

（三三）Vmax的应用的应用n定义定义：

Vmax指指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。

酶完全被底物分子饱和时的反应速度。

n应用：

应用：

Vmax可用来计算酶的转化率（可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。

当反秒。

当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：

转化率：

TN=底物转化量（底物转化量（mol/s）/酶量（酶量（mol）（四四）Km和和Vmax的测定的测定1Linweaver-Burk作图法作图法,又称为双倒数作图法又称为双倒数作图法1Km+SKm11=+vVmaxSVmaxSVmax2Cornish-Bowden作图法作图法又称为直线线性作图法。

又称为直线线性作图法。

第二节第二节酶活性测定方法及酶学分析的类型酶活性测定方法及酶学分析的类型n酶活性的测定方法酶活性的测定方法n工具酶工具酶n酶偶联测定法酶偶联测定法n底物浓度测定底物浓度测定一、酶活性的测定方法一、酶活性的测定方法按照按照对酶对酶促反应时促反应时间的选择间的选择不同不同连续监测法连续监测法固定时间法固定时间法

（一）固定时间法

（一）固定时间法n分类：

分类：

终点法：

在反应进行到预定时间后要终止反应。

两点法：

该方法反应时间的预定是从两点法：

该方法反应时间的预定是从tt11tt22。

n定义：

测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。

或产物的增加量。

n特点：

特点：

优点优点是简单是简单。

缺点缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。

是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。

n注意：

注意：

固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30306060分钟分钟为宜。

为宜。

（二）连续监测法

（二）连续监测法n原理：

原理：

测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。

该方法每隔一定时间（该方法每隔一定时间（10s10s60s60s）测定一次底物或产）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。

，绘制反应速度曲线。

在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法缺点：

缺点：

要求高，要求能够精确地控制温度、要求高，要求能够精确地控制温度、pHpH值和底物浓度等反值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。

动生化分析仪都能达到这些要求。

优点优点:

能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。

结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。

二、工具酶二、工具酶n定义：

偶联：

工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。

工具酶：

将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。

工具酶有工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类n分类：

表表7-27-2常用工具酶的名称及其缩写符号常用工具酶的名称及其缩写符号名名称称缩写符号缩写符号名名称称缩写符号缩写符号乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶过氧化物酶POD己糖激酶己糖激酶HK肌酸