抗生素发酵染菌原因及解决方法Word格式文档下载.doc
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在接种、并瓶等无菌操作过程中拔瓶塞时灰尘很容易落进瓶内,造成种子带菌。
要想实现摇瓶种子无杂菌,保持摇瓶间的清洁是非常关键的。
应当把摇瓶间当做洁净区区进行管理:
每日坚持用干净湿抹布擦拭摇瓶间的地而及墙而;
在充分消除对培养种子影响的情况不定期用消毒液如双氧水等对摇瓶间进行消毒。
1.2一级种子管接种操作不当染菌
火焰接种会导致一级种子罐染菌种子罐接种时,除按要求进行室内消毒外,还需要消毒人员与接种人员密切配合,快、准、稳地完成操作过程,否则易导致接种失败。
进行一级种子罐接种:
一是压差接种法,二是零磅接种法。
当采用零磅法接种时,罐压瞬时为零,外界空气就有可能从设备的泄漏处(如轴封等)及接种口进入罐内造成染菌。
因此,保持一级罐接种区的洁净度也是减少染菌的有效方法,应当做到:
一级种子罐要有单独的区域同其他生产区隔离;
保持一级种子罐区的环境卫生,一级种子罐区门窗日常应处于密闭状态,每次接种前用消毒液喷雾消毒;
环境定期用高锰酸钾熏蒸消毒。
有些公司将一级种子罐的接种口放置在无菌室内的净化工作台前,效果良好。
1.3蒸汽质量造成的染菌
由于受各方面因素影响,蒸汽质量波动很大。
有时蒸汽中冷凝水含量很高,总蒸汽压力较低,并且压力波动很大,温度低,这种蒸汽属于湿饱和蒸汽,灭菌效果较差,很容易造成染菌。
在生产进度允许的情况下,可采取空消的办法,排除蒸汽中的一部分冷凝水,待蒸汽相对干燥一些后,再正式进罐消毒灭菌。
也可以再进罐灭菌之前,开启各个蒸汽灌录上的冷凝水阀门排冷凝水,待蒸汽中含水量减少之后再进罐。
以上只是应急措施,要从根本上解决蒸汽中冷凝水的问题,还必须从蒸汽锅炉的设计容量、系统管路的合理安装、管道的保温等方面去解决。
需要特别注意的是消毒蒸汽管路不能连接非消毒设施,如采暖设备,职工澡塘的蒸汽,否则会造成发酵车间蒸汽压力下降和波动,甚至有菌物料和蒸汽的串连,因这种原因造成的染菌在很多厂家都发生过。
1.4空气系统引起的染菌
过滤器失效会导致染菌因空气系统带菌而导致罐染菌的机率较高。
空气系统容易出现的问题是:
无菌空气带油带水、空气过滤器质量和高效滤芯的安装质量等几个方面。
无菌空气中带油多来自往复式空气压缩机上,解决这个问题,首先应从采用无油润滑空压机着手。
无菌空气带水,主要是由压缩后的高温空气,经突然冷却后产生的。
除水设备泄漏、设计不合理或是失效是空气带水的主要原因。
增加必要的除油除水设备。
特别要注意定期排水,尤其是湿度大的阴雨天气。
采用无油润滑的空压机,从根本上解决。
若无法改造,可以在总空气过滤器上填充活性炭或玻璃棉减少油雾阻力。
空气过滤器滤芯要采用质量较好的厂家的产品。
使用尘埃粒子计数器等检测仪器和生物鉴定方法对过滤器是否失效进行准确、及时的判断
安装高效过滤器要注意以下几点:
高效过滤器的灭菌管路,一定要经过减压、温压、粗滤处理;
高效过滤器的空气进出口管路上安装监测口;
安装前一定要仔细检查卡口与O形圈的配合尺寸;
一般一个季度做一次检查;
发酵过程中染菌后要根据菌型判断杂菌的来源,不能草率的拆卸高效过滤器。
1.5降温设备泄漏和堵塞
发酵罐夹层和蛇形管的穿孔是造成染菌的主要原因之一。
冷水阀门内漏、夹套(蛇管)排水阀门堵塞也是造成染菌的主要设备因素。
在冷却设备制作过程中,应当选用不锈钢材质未原料进行冷却设备的加工制造。
冷却设备制造结束,应当进行严格个试漏检查,并应当进行射线探伤检查并拍片。
发酵车间应当建立冷却设备的定期检查及试压、试漏制度。
发酵罐必须每批下罐进行罐内设备的检查,防止蛇形管定位卡松动而造成穿孔泄漏。
1.6培养基带菌导致罐染菌
培养基颗粒过大会导致灭菌不彻底,培养基灭菌操作不到位导致灭菌不彻底培养基在灭菌过程中,对预热时间、蒸汽阀门的开度、灭菌温度、灭菌压力和泡沫控制等,都有严格要求,一个环节出现问题,就容易导致染菌。
预防方法:
培养基配制时应充分搅拌,并在输料管道上安装管道过滤器,以防止大颗粒固形物进入种子罐造成培养基灭菌不彻底。
若种子罐较小,配料量较小的情况下,最好将原料过筛,可有效防止此种情况。
灭菌前全面检查设备、消除灭菌死角,根据设备大小决定灭菌预热时间;
培养基灭菌时其蒸汽压力不得低于0.3MPa,根据培养基初始温度的不同决定阀门的开启程度。
灭菌过程中应保证与培养基相接触的管道大进蒸汽,与培养基不接触的管道小进蒸汽;
防止出现假压,要同时观察压力表和温度表,二者应符合对应关系,如有明显差异,可根据经验判断失灵者(一般以温度计为准)。
灭菌过程中进汽阀门应逐渐增大,排汽阀门应逐渐关小;
保压灭菌时应保证压力温度稳定。
2染菌的检查、原因分析
2.1染菌的检查与判断
在发酵过程中对杂菌污染的及早发现,及时处理,是免除染菌造成严重损失的重要问题。
因此,要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染,目前常用方法主要有以下几种:
2.1.1显微镜检查
通常用革兰氏染色法,染色后在高倍显微镜下观察,根据生产菌与杂菌的特征区别,判断是否染菌。
2.1.2平板划线培养或斜面培养检查法
先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度,保温至少24h检查无菌即可使用。
将需要检查的样品,在无菌平板上划线,分别置摄氏37度、摄氏27度培养,以适应嗜中菌和低温菌的生长,一般在8h后即可观察(但准确率较低)。
培养基(PH7.0):
葡萄糖0.5%,牛肉膏1.0%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5
%,琼脂1.0%
2.1.3肉汤培养检查法
将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中,放置摄氏37度和摄氏27度分别培养24h,进行观察,并取样镜检。
此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌,此时使用生产菌作为指示菌。
葡萄糖酚红肉汤培养基(PH7.2):
牛肉膏0.3%,葡萄糖0.5%,氯化钠0.5%,蛋白胨0.8%,1%酚红溶液0.4%。
用以上的检查方法检查未发现污染,还不能肯定未被污染。
除以上方法外,还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌,如溶解氧急剧降低、PH值剧烈变化、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
注:
有很多情况下,发酵培养基因使用酵母粉、玉米浆等含有大量菌体的物料配置培养基,显微镜下观察时难以判断,此时应遵循的一个原则是,若培养基染菌,其菌量应逐渐增加,若菌量未增加且菌型与培养基中所含菌形态一致的,应该不是染菌。
需要注意的是,开始染菌时间的判定和菌型的判定是非常关键的。
是接种前染菌还是接种后染菌、是补料前染菌还是补料后染菌、是补哪种料哪批料后染菌、染的是耐热菌型还是非耐热菌型、染的单一菌型还是混合菌型都是工艺人员判断染菌原因的依据。
取样都是在开放环境下进行的,难免有误差出现,为了避免误差,可以增加取样的频率和数量,特别是种子罐系统,万一出现难以判断的情况,较多的样品可以增加判断的依据。
2.2发酵染菌原因分析
在发酵染菌之后,必须分析染菌原因,总结发酵染菌的经验教训,把发酵染菌消灭在发生之前,防患于未然,是积极制服发酵染菌的最重要措施。
造成发酵染菌的原因很多,但总结归纳起来,其主要原因有:
无菌空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。
在发生染菌后,都要仔细利用显微镜观察培养基无菌斜面和肉汤(前期染菌要镜检供种方的无菌样),参考表一并参考以下方法进行分析,找出原因,杜绝污染。
表1各种微生物生长最适温度、pH及致死温度、致死时间范围
微生物
最适温度/℃
pH
致死温度/℃
致死时间t/min
酵母菌
25
3.8-6.0
50-60
5-10
霉菌
4.0-5.8
球菌
30
5.0-7.0
长短杆菌
37
6.5-7.5
60
10
芽孢杆菌
100
6-17
2.2.1从染菌时间来看
2.2.1.1发酵早期染菌
可能原因有:
种子带菌,培养基和设备灭菌不彻底,接种操作不当,无菌空气带菌;
发酵后期染菌,可能原因有:
中间补料污染,设备渗漏,操作问题。
种子带菌:
一般根据种子制备过程中的无菌样和接种后剩余种子做的无菌样进行监测。
根据实际情况看,种子带菌多是操作带入,一般为球菌。
但笔者也遇到了菌种因摇瓶培养基未消透而出现染菌的情况,一次为更换了一种原料,其中有大量杂菌,使用原工艺难以完全灭菌。
一次为使用了较大摇瓶,由750ml摇瓶装80ml改为5000ml摇瓶装量500没了,在没有进行验证的情况下使用原工艺进行灭菌,结果因装量大,摇瓶升温慢(灭菌柜测量的是排气口的温度而不是培养基的温度),导致摇瓶培养基染菌。
需要特别注意的是,若监测种子的无菌样都正常,就应当立即放弃种子带菌的可能,把精力转移到其他方面去寻找真正的染菌原因,否则会影响原因的查找。
一级种子罐染菌未镜检出带入发酵罐:
一般15小时内发酵罐就有所表现能直接在发酵液内看到杂菌。
此时,种子罐的无菌斜面可镜检出杂菌,比较好判断。
培养基和设备灭菌不彻底:
一般情况为芽孢,可根据无菌样品排除各种原因后判定是否是此种原因。
发酵设备的泄漏,尤其是冷却设备的泄漏,夹层、蛇形管或连消装置喷淋冷却器的穿孔也是发酵前期染菌的主要原因。
其菌量的大小一般和泄漏的严重程度相关。
接种操作不当:
一级种子罐接种不当,一般根据当天接种人员的反应、无菌样起染时间判断。
一般染球,也有其他菌型。
无菌空气带菌:
此种情况下,菌型一般比较杂,一般在2种或2种以上,一般在消后无菌样就可观察到染菌。
定期拆过滤器检修是杜绝此类染菌的办法之一。
2.1.2.2发酵中后期染菌
中期染菌一般从发酵设备的死角、设备的泄漏、补料设备等方面查找原因。
也有可能是操作不当比如泡沫顶罐所致。
补料罐染菌表现很明显,就是所有运转罐基本在同一时间染菌,且菌型一致。
罐体泄漏一般会比较明显,较容易发现。
盘管或夹套漏就比较难发现,需要打压试漏,仔细检查。
2.2.2从污染的杂菌种类来看
污染耐热的芽孢杆菌,可能是培养基或设备灭菌不彻底;
污染球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌,设备渗漏;
污染霉菌,一般是菌种带菌、罐体大的泄漏或操作问题。
2.2.3从染菌的幅度来看
如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌,而且所污染的是同一种杂菌,杂菌的主要来源可能是空气净化系统、补料系统、蒸汽系统等公共系统;
如果只是发酵罐大面积染菌,除考虑空气净化系统带
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