实验四PCR产物的T载体克隆和转化_精品文档PPT课件下载推荐.ppt
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-表示不可用,比较内容质粒噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量10kb22kb4050kb1kb基因组DNA文库-+-cDNA文库+-亚克隆+-+序列分析+-+E.coli表达+-,二、载体的选择与准备选,三、DNA分子的体外连接接,
(一)黏性末端,
(二)人工接头的使用,(三)加入同聚体尾,(四)平端连接,
(一)黏性末端,
(二)人工接头,(三)加入同聚体尾,待克隆DNA片段,重组质粒,混合、退火,空白质粒,(四)平端连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,53T(T)nT,T(T)nT35,3A(A)nA,A(A)nA,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,5,35,四、外源DNA导入宿主细胞转,受体菌条件:
安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式:
转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),外源基因导入宿主细胞后,筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。
五、目的基因的筛选和鉴定筛,1.借助载体上的遗传标志进行筛选
(1)利用抗生素抗性标志筛选
(2)利用基因的插入失活/插入表达特性筛选(3)利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选,2.序列特异性筛选
(1)RE酶切法
(2)PCR法(3)核酸杂交法(4)DNA测序法,
(一)遗传学方法,1.插入灭活法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,2.蓝-白筛选(互补),许多载体(如M13系列、pUC系列、pGEM系列)都含有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。
这个编码区中插入了一个多克隆位点。
这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。
宿主和载体编码的片段各自均无酶活性,但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶,使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物,出现蓝色的菌落。
如果在多克隆位点上插入外源DNA片段,将使lacZ基因灭活,不能生成有活性的-半乳糖苷酶,结果菌落呈现白色。
互补筛选(蓝-白筛选),PCR产物的T载体克隆和转化,实验目的:
学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。
实验要求:
掌握利用T载体克隆PCR产物的方法;
复习连接实验流程。
技术应用:
目的基因片段与T载体DNA连接,达到克隆基因的目的。
材料:
目的基因片段(回收的PCR产物)药品:
pEMGT-Vector(Promega公司),质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。
大小约为数千碱基对。
常有13个抗药性基因,以利于筛选。
质粒载体,克隆的质粒载体允许外源的DNA插入,储存。
主要是DNA水平上的操作。
基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。
实验原理,普通Taq酶会在3末端加一个A,这样所有PCR产物都会在双链DNA的3端均有一个单链状态的A;
T-载体是线状DNA片段,在DNA双链的3端均有一个单链状态的T;
二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子,从而达到克隆的目的。
载体结构的三大要素:
多克隆位点选择标记(耐药性,LacZ)独立的复制单位,pGEM-T载体的结构,pGEM-TEasy载体的结构,实验步骤,
(1)目的片段的制备-胶回收法回收PCR产物:
(2)连接实验:
在0.2mlPCR管加入以下试剂:
目的片段(100ng/ul)3lpGEM-TEasy(50ng/ul)1lT4DNALigase1l2RapidLigationBuffer5lTotal10L备注:
混合均匀,瞬时离心。
4连接16小时,-20储存或直接用于转化。
说明,1.回收DNA片段可以用沉淀法,但是只适用于PCR扩增产物为单一片段,而且需要检测PCR扩增结果后进行;
2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3末端加一个A的原理发明的;
注意不同的酶的性能不同,保真性强的Taq酶会自动切除末端的A,所以,这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。
3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法,方便,快捷。
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