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质粒的一般生物学特性:
u分子大小差异大:
分子大小差异大:
1200kb1200kbu编码基因少:
编码基因少:
2323个中等大小的蛋白质。
个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等,赋予细如抗菌素抗性、代谢特征等,赋予细如抗菌素抗性、代谢特征等,赋予细如抗菌素抗性、代谢特征等,赋予细菌一些额外的特性(非必须)。
菌一些额外的特性(非必须)。
u形状:
形状:
双链环状双链环状双链环状双链环状DNADNA;
线线性双性双性双性双链链DNADNA;
超螺旋等。
;
u质粒的空间构型:
质粒的空间构型:
u质粒空间构型与电泳速率:
质粒空间构型与电泳速率:
同一质粒尽管分子量相同,不同的构型电泳迁移率不同,scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。
1.共价闭合环状DNA(CovalentclosecircularDNA,cccDNA),呈超螺旋(SC)(supercoil)2.开环DNA(opencircular,ocDNA),一条链上有一至数个缺口3.线形DNA(linear,lDNA)u质粒的类型:
质粒的类型:
在大肠杆菌中的质粒,可以分为:
1、接合型质粒(能自我转移):
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带、接合型质粒(能自我转移):
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如:
F质粒(性质粒、或质粒(性质粒、或F因子)。
因子)。
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不不符合基因工程的安全要求。
符合基因工程的安全要求。
2、非接合型质粒(不能自我转移):
虽然带有自我复制所必需的遗传信息,、非接合型质粒(不能自我转移):
虽然带有自我复制所必需的遗传信息,但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因,因此不能从一个细胞转移到另一但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因,因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
个细胞。
如如R质粒(抗生素抗性质粒)和质粒(抗生素抗性质粒)和Col质粒(大肠杆菌素质粒(大肠杆菌素colicin)。
)。
符合基符合基因工程的安全要求。
因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素(大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素(bacteriocin),对于其他不能分泌特异性大肠),对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免疫蛋白(杆菌素免疫蛋白(Immunityprotein)的细菌具有杀灭作用,现在一般认为有调节菌群数)的细菌具有杀灭作用,现在一般认为有调节菌群数量的作用。
量的作用。
大部分大肠杆菌素由质粒编码,其中最著名的没过于大部分大肠杆菌素由质粒编码,其中最著名的没过于pColE1。
u质粒的复制类型质粒的复制类型严紧型质粒(严紧型质粒(stringentplasmid):
拷贝数少,只有拷贝数少,只有拷贝数少,只有拷贝数少,只有1313份拷贝。
份拷贝。
(接合型质(接合型质(接合型质(接合型质粒分子量大,一般属严紧型)。
粒分子量大,一般属严紧型)。
松弛型质粒(松弛型质粒(relaxedplasmid):
拷贝数多,有拷贝数多,有拷贝数多,有拷贝数多,有10601060份拷贝。
(非接合型质(非接合型质(非接合型质(非接合型质粒分子量小,一般属松弛型)。
粒分子量小,一般属松弛型)。
u质粒的不相容性质粒的不相容性又称质粒的不亲和性,在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同又称质粒的不亲和性,在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存,这一现象称为质粒的不相容性质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存,这一现象称为质粒的不相容性,又又称质粒的不亲和性。
称质粒的不亲和性。
u质粒的复制过程质粒的复制过程质粒的复制主要是通过质粒的复制主要是通过型复制型复制和和滚环复制滚环复制两种方式之一进行的,其中以两种方式之一进行的,其中以型型复制为主。
在复制为主。
在型复制中,有单向半保留复制和双向半保留复制。
型复制中,有单向半保留复制和双向半保留复制。
Ori复制复制起起点点型复制型复制型复制型复制滚环复制滚环复制滚环复制滚环复制在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。
复制起点复制起点(oriori)区的功能区的功能u复复制制起起点点是是一一段段特特定定的的DNA序序列列,长长约约几几百百碱碱基基对对,在在其其相相关关的的调调控控元元件件中中含含有由质粒或宿主染色体编码的、参与有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。
合成起始调控因子的结合位点。
u在在大大多多数数质质粒粒中中,与与复复制制有有关关的的蛋蛋白白质质基基因因位位于于ori序序列列附附近近,因因此此ori位位点点周周围围的小范围的小范围DNA是质粒复制所必需的。
是质粒复制所必需的。
u如如果果质质粒粒DNA的的大大部部分分区区域域被被去去掉掉,而而只只保保留留质质粒粒的的ori序序列列,而而且且质质粒粒是是环环状状的,则质粒仍然能进行复制。
的,则质粒仍然能进行复制。
u将将oriori区区克克隆隆到到一一个个不不能能自自主主复复制制的的环环状状双双链链DNADNA分分子子上上并并引引入入到到原原核核细细胞胞后后,该该重重组组DNADNA具具有有自自主主复复制制能能力力。
分分子子克克隆隆中中常常用用的的质质粒粒载载体体就就是是以以这这种种方方法法构构建建的,同时用这种方法可以确定哪部分的,同时用这种方法可以确定哪部分DNADNA是是oriori区并研究区并研究oriori区的功能。
区的功能。
uoriori区域常决定了质粒的许多特性,如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。
区域常决定了质粒的许多特性,如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。
质粒的命名质粒的命名用小写字母p代表质粒(plasmid),在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称,再加上质粒编号。
pBR322:
p表示一种质粒,而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez,322为编号。
质粒载体的构建质粒载体的构建u天然质粒的局限性天然质粒的局限性1、分子量大,拷贝数低,第一个用于基因克隆的天然质粒、分子量大,拷贝数低,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101,分子长,分子长9.1kb。
但只但只有一个有一个EcoRI切点充当克隆位点,切点充当克隆位点,Tetr作为筛选标志。
作为筛选标志。
EColRI酶切位点位于酶切位点位于Tetr基因外基因外部,外源基因插入不会引起筛选基因失活,因此无法区别重组体和野生型质粒。
部,外源基因插入不会引起筛选基因失活,因此无法区别重组体和野生型质粒。
2、天然质粒、天然质粒ColE1质粒,长度为质粒,长度为6.3kb,唯一的唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素菌素E1(colicinE1)内部。
)内部。
colicinE1能杀死不含能杀死不含ColE1质粒的菌,形成质粒的菌,形成“噬菌斑噬菌斑”。
可。
可以通过插入失活筛选。
但细菌群体容易自发突变出抗以通过插入失活筛选。
但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞。
的细胞。
u质粒载体的发展概况质粒载体的发展概况第一阶段(第一阶段(1977年前):
天然质粒和重组质粒的利用,如年前):
天然质粒和重组质粒的利用,如pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322。
第二阶段:
增大载体容量第二阶段:
增大载体容量(降低载体长度降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如如pUC系列载体。
系列载体。
第三阶段:
完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如第三阶段:
完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如M13mp系列载体,含系列载体,含T3,T7,sp6启动子载体,表达型载体及各种探针型载体。
启动子载体,表达型载体及各种探针型载体。
理想质粒载体必须具备的基本条件:
u1、具有复制起点(ORI)u2、具有抗菌素抗性基因:
是筛选的标志。
理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。
u3、若干限制性内切酶的单一位点:
用来插入外源DNA片断。
且插入后不影响复制功能。
u4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。
质粒的选择标记及其工作原理:
uu抗菌素抗性抗菌素抗性抗菌素抗性抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记.氨苄青霉素抗性(氨苄青霉素抗性(Ampr):
青霉素的衍生物。
氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应,杀死生长的细菌。
Ampr基因编码-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
卡那霉素抗性(卡那霉素抗性(Kanr):
卡那霉素通过与70S核糖体结合,导致mRNA发生错读,从而杀死细菌。
Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用。
四环素抗性(四环素抗性(Tetr):
四环素通过于30S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
杀死生长的细菌。
Tetr编码特异性蛋白质,对细菌的膜结构进行修饰,组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
链霉素抗性(链霉素抗性(Strr):
链霉素通过与30S核糖体亚基结合,导致mRNA错译,从而杀死细菌。
Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰,阻断其与核糖体30S亚基结合作用。
氯霉素抗性(氯霉素抗性(Cmlr):
氯霉素通过与50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。
Cmlr编码乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活。
人工构建的质粒载体的类型人工构建的质粒载体的类型u高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体pColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
在没有菌体蛋白质合成的条件下(蛋白质合成抑制剂,氯霉素等存在下)仍能复制,达到每个细胞的拷贝数10003000个。
适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。
u低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小,拷贝数低,不适合大量扩增DNA用。
但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动,导致寄主菌死亡时,就需要低拷贝的载体。
如pLG338、pLG339、pHSG415等。
u失控的质粒载体失控的质粒载体温度敏感型复制控制质粒,温度低于37度,拷贝数很少;
温度增加,大于40度时,拷贝数会很快增加到1000个以上。
B.E.Uhlin于1979年构建的载体如pBEU1、pBEU2等。
u插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某
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