荧光定量PCR实验操作流程_精品文档PPT格式课件下载.ppt
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释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离。
细胞悬液离心,倒掉上清,加入1mlRLT;
反复吹打,使样本充分裂解;
室温放置5min,使核酸蛋白复合物完全分离,1.裂解:
2.抽提:
加入200ul氯仿,剧烈振荡15s,室温放置2min;
412,000rpm离心10分钟,此时样品分为三层;
上层无色水相,中间白色蛋白质相,下层红色有机相,RNA在上层水相中,细胞RNA提取,3.过柱子:
吸取上层水相,至新的RNase-Free管中(注:
不要吸到中层)加入等体积70%的乙醇,颠倒混匀;
将溶液全部加入到已装入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱(SpinColumnRM)中。
若一次(700ul)不能加完溶液,可分多次入;
12,000rpm离心20s,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中;
4.洗涤:
向吸附柱加入700lBufferRW1,12,000rpm离心20s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
向吸附柱中加入500lBufferRW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心20s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;
重复步骤8;
12,000rpm离心2min,弃废液,吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干;
细胞RNA提取,5.洗涤:
将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(CollectionTube1.5ml)中向吸附柱的中间部位加入30-50lRNase-FreeWater,室温放置1min,12,000rpm离心1min,收集RNA溶液,进行后续试验或-70保存RNA,防止降解。
注意:
1)RNase-FreeWate体积不应小于30l,体积过小影响回收率。
2)若提高RNA的产量,可用30-50l新的RNase-FreeWater重复步骤5。
3)若提高RNA浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤5。
6.RNA检测:
用ddH2O,对仪器进行调零;
取1ul的RNA溶液进行测定;
测定样品纯度和浓度。
纯度:
OD260/OD280=1.9-2.12.2RNA水解浓度:
RNA(ug/ml)=40OD260*稀释倍数,细胞RNA提取,逆转录,实验材料:
HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒,RNA实验步骤:
1.将RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、DTT、RTBuffer、HiFi-MMLV和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
2.根据以下表格配置反应体系,总体积为20l。
3.涡旋震荡混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。
4.42孵育3050分钟,70孵育15分钟。
反应结束后,短暂离心,置于冰上冷却。
5.逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR,或置于-20长期保存。
逆转录,荧光定量PCR,材料:
2UltraSYBRGreenMixture,cDNA,actin引物实验步骤:
1.稀释模板:
每稀释一个倍数,需要将溶液混匀,并短暂离心。
2.配制PCR预混反应体系:
做5个样本,配制8个样本的预混体系,配制方式如下:
3.将配制的预混体系,分装到八连管中。
共加6个孔,每个孔中加入18l的预混体系。
荧光定量PCR,4.模板加入:
每个孔中分别加入2l模板,加样顺序如下:
5.混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。
6.PCR反应程序:
注意事项:
1首先配制预混体系,再将预混体系分装到八连管中。
2.稀释模板时,需要混匀。
不要直接在八连管管壁或管盖上做标,荧光定量PCR,ThankYou!
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