分子生物学的应用技术ppt_精品文档PPT课件下载推荐.ppt
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,2、环境因素激素、药物,细胞因子、机械刺激、病原体感染、电刺激、细胞转化.,研究基因表达的手段,1、RT-PCR(RNA)2、Northernblot(RNA)3、Westernblot(蛋白质)4、免疫组化(蛋白质),原位杂交、点杂交、RNA酶保护试验基因芯片,1、RT-PCR,基本原理:
将细胞中mRNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,进行PCR反应。
根据PCR产物的量,判断基因表达的强度。
RT-PCR是一种半定量方法,实验操作:
1)RNA提取:
Trizol试剂盒。
防止RNA降解,RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。
2)逆转录:
RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物(随机引物,OligodT),3)PCR,特异性引物、模板、Taq聚合酶。
通过PCR,将目的片段扩增几十百万倍。
在一定范围内和一定的条件下,PCR的产物量与模板量呈正比关系。
模板量,4)几个注意问题:
反应平台内参1、PCR效率差异,重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段长度5、mRNA丰度,目标片段与内参片段,iNOS(诱导型一氧化氮合酶)GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶),5)PCR产物量的测定,应用图象分析软件进行密度测定。
100%,160%,ABCD,2.02.0,2.01.0,2.02.0,1.01.0,RT-PCR特点:
优点:
灵敏度高、特异性高、操作简便。
缺点:
可靠性差、不能细胞定位。
2、Northernblot,标记探针与膜固相RNA杂交。
根据杂交信号强弱判断表达量,根据杂交信号位置判断分子长度。
杂交信号,实验操作:
1)RNA提取2)RNA电泳(分离不同长度RNA)3)转膜(形成固相RNA)4)探针标记(同位素/非同位素)5)预杂交,杂交6)洗膜7)显影(放射性/酶促),Northernblot特点:
因为没有扩增过程,Northernblot的结果可靠性高。
可以确定未知基因的转录产物(mRNA)长度。
1、操作烦琐2、同位素3、灵敏度低4、对RNA质量要求高5、不能定位细胞,3、Westernblot,标记抗体与膜固相蛋白作用。
根据信号强弱判断蛋白表达强度。
根据信号位置判断蛋白分子量。
标准分子量蛋白,特异性反应带,1)蛋白提取2)蛋白电泳(分离不同分子量蛋白)3)转移4)封闭5)一抗作用6)标记二抗(HRP/AP标记)作用7)显色,实验操作:
Westernblot特点:
直接检测蛋白质的表达量。
灵敏度低一抗制备难度大,购买价格高容易出现交叉反应不能细胞定位,4、免疫组化,标记抗体与组织细胞作用。
根据信号强弱判断表达强度,根据信号位置判断表达细胞。
eNOS表达,(对照),(实验),实验操作,1)组织切片(石蜡/冰冻)2)封闭,内源性过氧化物酶失活3)一抗作用4)二抗(HRP标记)作用5)显色6)复染,封片,免疫组化特点:
细胞定位,缺点:
定量不准确,人为因素干扰大(图象分析系统),5、基因芯片,特定载体上密集的大量探针与荧光标记的样品反杂交。
根据杂交信号强弱判断基因表达强度。
基因芯片特点:
一次杂交可以得到大量表达信息。
通用性好。
成本高,需要专门设备。
人类基因组计划揭示了人类有34万个基因,转录本多达10万个。
基因不同时空表达是细胞结构和功能的基础;
是组织、器官和系统发育和分化的基础;
也是大多数细胞病变的基础。
了解不同状态下的基因表达调节机制是后基因组时代的主要任务,是探索生命本质的重要环节。
结束语,谢谢,
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