专题五1DNA粗提取与鉴定_精品文档PPT推荐.ppt
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6、二苯胺试剂。
实验用具:
铁架台;
铁环;
镊子;
三角架;
酒精灯;
石棉网;
载玻片;
玻璃棒;
滤纸;
滴管;
量筒(100ml,一个);
烧杯;
(100ml,一个,50ml、500ml各二个);
试管(20ml,二个);
漏斗;
试管夹;
纱布。
8、DNA的鉴定,DNA与二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,紫外灯照射法,A、配制染色剂,用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭(EB),B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴一滴EB溶液染色,C、将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射(暗室中),可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处),甲基绿(蓝绿色),二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,
(一)实验材料的选取,材料:
新鲜的鸡血,注意:
本实验中,要往鸡血中加入抗凝剂(柠檬酸钠溶液),原则上只要含DNA的生物材料都可以,但是选取DNA含量相对较高的生物组织,成功率更大。
(1)先将新鲜的鸡血离心,获得鸡血细胞
(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可,
(二)破碎细胞,获取含DNA的滤液,1、破碎细胞,讨论:
为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
利用了什么原理?
2、过滤,获取含DNA的滤液,讨论:
为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质,答:
用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;
用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,讨论:
方案二与方案三的原理有什么不同?
答:
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的DNA与蛋白质分开;
方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与DNA分离方案二利用了酶的专一性;
方案三利用了DNA的稳定性。
(四)DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数为95),静置2-3min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取DNA。
用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,2、DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中,其中一只加入DNA丝状物,各加入二苯胺4ml试剂。
混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两只试管中溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,
(一)案例一:
以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破,而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心,对设备要求较高,操作繁琐,历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富,材料易得,2、实验原理,DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。
DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液(抗凝剂)100ml,置于500ml烧杯中。
注入新鲜的鸡血(约180ml),同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸纳溶液充分混合,以免凝血。
将烧杯中的血液置于冰箱内,精置一天,使血细胞自行沉淀。
(也可以将血液倒入离心管内,用1000r/min(转每分)的离心机离心2min,血细胞沉淀于离心管底部。
实验时。
用吸管除去离心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。
),过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应,生成柠檬酸钙络合物,血浆中游离的Ca2+大大减少,血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取过程中为了减少DNA的损失,最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,讨论:
提取鸡血中的DNA时,为什么除去血液中的上清液?
血液分为两部分,一部分是血浆,一部分是血细胞,离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5mL10mL,注入到50mL烧杯中。
向烧杯中加入蒸馏水20mL,同时用玻璃棒充分搅拌5min,使血细胞加速破裂。
然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。
取其滤液。
提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论:
让细胞内浓度大于周围溶液的浓度,细胞会吸水以至胀破,
(1)为什么要加入蒸馏水?
加入蒸馏水后细胞会有什么变化?
(2)用玻璃棒搅拌有什么意义?
用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。
注意应沿一个方向快速搅拌,但也不能太快太猛,防止打碎DNA,(3)滤去的是什么物质?
得到的是什么?
过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质;
得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶40mL加入到滤液中,并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min,使其混合均匀,这时DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。
继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。
当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14molL),析出含DNA的粘稠物,讨论:
加入蒸馏水的目的?
降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点,使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离,这一步骤是实验成败的关键。
实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水,并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌,以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项:
滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中,含DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取1个50mL烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2molL的溶液20mL。
用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃择不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100mL烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。
取其滤液,DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为95的溶液50mL(使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳),并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。
用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。
这种丝状物的主要成分就是DNA,答:
因为DNA不溶于冷酒精,而其他物质可以溶解在酒精中,使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论:
(2)观察丝状物呈什么颜色?
白色,
(1)为什么要加50mL的冷酒精?
取两支20mL的试管,各加入氯化钠的物质的量浓度为0015molL的溶液5mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。
然后,向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。
混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA的鉴定,讨论:
有丝状物的试管变成蓝色,另一试管还是原来颜色,
(2)这一鉴定结果说明什么问题?
(1)比较两个试管中溶液的颜色有什么不同?
提取出的丝状物是DNA,(3)DNA的直径约为2010-10m,实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小?
DNA分子直径只有2nm。
丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,答:
整个实验共“两次蒸馏水,三次过滤,两次析出,六次搅拌”,6、讨论:
两次蒸馏水,第一次:
细胞吸水胀破第一步第二次:
使DNA黏稠物析出第三步,
(1)此实验过程中有几次使用蒸馏水?
几次过滤,几次析出,几次搅拌?
分别在哪一步?
过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关,第二次要用其滤出的黏稠物有关,所以要使用多层纱布,第一次和第三次均要用其滤液,使用的纱布为12层,三次过滤,第一次:
DNA存在于滤液里第一步第二次:
DNA被留在纱布上第四步第三次:
DNA存在于滤液里第六步,两次析出,第一次:
用0.14molL的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次:
用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌:
第一、二、三、五、七步,其中除第八步外,其余均要朝一个方向搅拌,在第三、五步搅动还要轻缓,玻璃棒不要直插烧杯底部,这样才能保证得到完整的DNA,
(2)为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?
因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,1、在制备鸡血细胞液的过程中,加入柠檬酸钠的目的是()A.防止凝血B.加快DNA析出C.加快DNA溶解D.加速凝血,练一练,A,2、DNA的溶解度最低时,NaCl的物质的量浓度为()A2mol/lB0.1mol/lC0.14mol/lD0.015mol/l3、在向溶解DNA的NaCl溶液中,不断加入蒸馏水的目的是()A加快DNA溶解的速度B加快溶解杂质的速度C减小DNA的溶解度,加快DNA析出D减小杂质的溶解度,加快杂质的析出,C,C,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是A减小;
减小B增大;
增大C先减小后增大D增大;
减小5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出,最有效的办法是A加蒸馏水B加矿泉水C加清水D加生理盐水,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述,不正确的是A操作时缓慢滴加蒸馏水,降低DNA的溶解度B操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整C加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度D当丝状粘稠物不再增加时,NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗?
用甲基绿染液。
结果丝状呈现绿色。
8、DNA遇二苯胺会染成(沸水浴)A硅红色B红色C紫色D蓝色,D,
(二)案例二:
以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h,2、提取DNA的具体步骤,取材:
称取30g菜花,去梗取花,切碎,研磨:
将碎菜花放入研钵中,倒入10mL研磨液,充分研磨10min,过滤:
在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1000r/min的转速,离心25min,取上清液放入烧杯中)。
在4冰箱中放置几分钟后,再取上清液,沉淀:
将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中,并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。
沉淀35min后,可见白色的DNA絮状物出现。
用玻璃棒缓缓旋转,将絮状物缠绕在玻璃棒上,观察你提取的DNA颜色,如果不是白色丝状物,说明DNA中的杂质较多;
二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功,如果不呈
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