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,反相色谱中分析方法的建立:
反相方法建立的推荐步骤:
1.调整%B,使0.5k20,(1k10更好)2.检查峰拖尾或塔板数低的现象3.如果必要,调整选择性a.微调%Bb.改变有机溶剂c.混合有机溶剂d.改变柱类型e.改变温度4.优化柱条件(柱长、颗粒尺寸、流速),混合溶剂的使用:
柱类型的影响:
不同溶剂与柱类型的结合使用:
正相色谱分析方法的建立,1.样品在RPC中不保留(亲水性太强)2.样品在RPC中保留太强(疏水性太强)3.采用RPC分离不能获得足够的峰间距(=1)4.样品含有空间异构体,立体异构体或非对映异构体5.期望回收到大量疏水性样品组分(制备色谱)6.样品溶于非极性溶剂(若采用RPC柱,会对直接进样造成问题),使用正相色谱(NPC)的理由:
正相色谱保留机理,正相分析方法建立的推荐方法:
1.调整%B,使0.5K20,(氰基柱、己烷-丙醇做流动相)2.检查峰拖尾现象3.如必要,调整选择性a.微调%Bb.改变有机溶剂种类(MC、MTBE、EtAc);
微调%Bc.混合有机溶剂d.改变柱类型(二醇、氨基、硅胶);
微调%B4.优化色谱柱条件(柱长、颗粒大小、流速),NPC溶剂选择性实验的对应色谱图150.46cm硅胶柱,流动相如前,2.0ml/min,350C。
样品为取代萘混合物,取代基:
12-OCH3,21-NO2,31,2-(OCH3)2,41,5-(NO2)2;
51-CHO,82-CHO,91-CH2CN,101-OH,111-COCH3,122-COCH3,132-OH。
GPC分析方法,SEC保留机理,GFC:
凝胶过滤色谱水相流动相分离水溶性大分子固定相:
多糖型凝胶、多孔交联聚甲基丙稀酸酯类树脂、交联聚乙稀基醇树脂、羟基化聚醚类亲水性树脂等。
GPC:
凝胶渗透色谱有机相流动相分离脂溶性高分子固定相填料:
苯乙烯-二乙烯苯多孔微球系列,理想SEC填料的性能要求,SEC填料的色谱特征:
SEC应用:
分离复杂样品,然后再以高分辨率的HPLC分离纯化.分析纯化高分子化合物,以确定单聚、二聚和多聚物.以校正曲线估算大分子物质分子量.,实例:
凝胶渗透色谱法测定羟乙基淀粉分子量,色谱条件:
1.色谱仪器:
pharmaciaLKBHPLCpump2248KNAUERDifferental-referactometer2.色谱柱:
ShodexOHpakSB-804HQ(聚羟甲基丙烯酸酯凝胶)规格:
柱名排阻限(Pullulan)粒径(m)尺寸(mm)SB-804HQ1,000,000108.0x3003.流动相:
0.7%硫酸钠+0.02%叠氮化钠4.流速:
0.5ml/min5.柱温:
35,实验步骤:
1.选用分子量为2000000和180的两种淀粉确定该色谱柱的检测窗口,见图一。
图一:
分子量为180的淀粉的色谱图tR1:
19.673min分子量为2000000的淀粉的谱图tR0:
12.902min,2.分别以分子量为11800、22800、47300、112000、212000淀粉标准品,其相应的GPC谱图,见图二。
图二:
分子量为11800淀粉谱图tR2:
16.965分子量为22800淀粉谱图tR2:
16.230分子量为47300淀粉谱图tR2:
15.445分子量为112000淀粉谱图tR2:
14.930分子量为2000000淀粉谱图tR2:
13.720,3.标定曲线的确定,4.未知淀粉谱图,y=-2.692x+5.6637R2=0.9989X=(VR-VR1)/(VR0-VR1)tR1:
19.673mintR0:
12.902mintR1:
14.530计算得:
未知淀粉M=29046,银杏内酯色谱条件:
色谱柱:
BaselineC184.6150mm,5m流动相:
甲醇:
水:
四氢呋喃=25:
65:
10流速:
1ml/min检测:
ELSD,蒸发管温度85,气体流速4.0Bar,系统评价,五种二氢吡啶类药物色谱条件:
BaselineC184.6250mm,5m流动相:
水=75:
25流速:
1ml/min检测:
UV237nm,系统评价,酚咖片色谱条件:
BaselineC18,4.6250mm,5m流动相:
冰醋酸=32:
3流速:
UV275nm,酚咖片色谱图(d/qhq/酚咖片/B0029,5.0l),系统评价,五.HPLC定量分析方法,1.归一化法:
以峰面积为基础的归一化法加校正因子的归一化法2.外标法:
外标曲线法外标一点法3.内标法:
内标曲线法内标一点法内标加校正因子法4.标准加入法,1.归一化法:
1.1以峰面积为基础的归一化法1.2加校正因子的归一化法相对校正因子:
2.外标法2.1外标曲线法,2.2外标一点法:
内标法,3.1内标曲线法,3.2内标一点法:
3.3内标加校正因子法:
相对校正因子:
例2校正因子法的测定复方炔诺酮片中炔诺酮的含量ODS色谱柱、甲醇水(60:
40)流动相、监测器UV280nm、对硝基甲苯为内标物。
(1)校正因子的测定:
取对硝基甲苯(内标物)、炔诺酮和炔雌醇对照品适量,用甲醇制成10ml容量,进样10ul,记录色谱图。
重复3次。
测得含0.0733ml/ml内标物、0.600mg/ml炔诺酮和0.035mg/ml炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表。
(2)试样测定:
取本品20片,精密称定,求出平均片重(60.3mg/片)。
研细后称取732.8mg(约相当于炔诺酮7.2mg),用甲醇配制成10ml供试品溶液(含内标物0.0733mg/ml)。
测得峰面积列于表。
计算炔诺酮的校正因子和复方炔诺酮片中炔诺酮的含量。
表复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积(VS),炔诺酮的含量为:
每片含炔诺酮的量为:
60.30.97%=0.586(mg/片),炔诺酮的校正因子:
4.标准加入法,例3欲测定二甲苯的混合试样中的对二甲苯的含量,称取该试样110.0mg,加入对二甲苯的对照品30.0mg,用反相色谱法测定。
加入对照品前后的色谱峰面积(mm2)值为,对-二甲苯:
A对40.0,A对104.2;
间-二甲苯:
A间141.8,A间156.2。
试计算对-二甲苯的百分质量分数。
对-二甲苯的质量:
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