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供体向受体转移的过程。
质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类,转移质粒带有质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类,转移质粒带有质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类,转移质粒带有质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类,转移质粒带有完整的编码转移酶的完整的编码转移酶的完整的编码转移酶的完整的编码转移酶的tratra基因,质粒能自主地从一个细胞基因,质粒能自主地从一个细胞基因,质粒能自主地从一个细胞基因,质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体DNADNA向受体细胞转移,这类质粒常被称为自主转移质粒。
向受体细胞转移,这类质粒常被称为自主转移质粒。
如大肠杆菌的如大肠杆菌的如大肠杆菌的如大肠杆菌的FF质粒。
质粒。
有些质粒不含有些质粒不含有些质粒不含有些质粒不含tratra基因,但含有质粒转移起始位点基因,但含有质粒转移起始位点基因,但含有质粒转移起始位点基因,但含有质粒转移起始位点oriToriT,虽不能自主转移,但能被其他一些含完整虽不能自主转移,但能被其他一些含完整虽不能自主转移,但能被其他一些含完整虽不能自主转移,但能被其他一些含完整tratra基因的质粒基因的质粒基因的质粒基因的质粒所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。
所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。
本实验所用供体质粒本实验中要转移的质粒本实验中要转移的质粒本实验中要转移的质粒本实验中要转移的质粒pSET152pSET152,5.5kb,基因基因型为型为C31int/attP,aac(3)IV,pUC18复制子复制子,lacZ,链霉菌的两亲本接合转移实验菌株实验菌株供体菌:
供体菌:
E.coliS17-1/pSET152受体菌受体菌:
StreptomyceslividansZX1(变铅青链霉菌)(变铅青链霉菌)实验产物实验产物接合转移子接合转移子:
StreptomyceslividansZX1/pSET152实验准备工作实验准备工作菌株准备菌株准备(教师做)(教师做):
1.供体准备供体准备a)培培养养E.coliS17-1/pSET152:
接接种种到到液液体体LB培培养养基基5ml+Apr50g/ml,37震震荡荡培培养养过过夜夜。
第第二二天天扩扩大大培培养养至至50mlLB+Apr50g/ml。
b)浓浓缩缩:
每每50ml的的培培养养物物浓浓缩缩到到5ml,每每1.5ml的的离离心心管管分分装装1ml。
2.准备链霉菌准备链霉菌S.lividansZX1的孢子的孢子将将链链霉霉菌菌孢孢子子用用TSB清清洗洗两两遍遍,再再用用TSB悬悬浮浮,每每1.5ml的的离心管分装离心管分装100ul。
(需要现做现用)。
(需要现做现用)操作步骤(第一天)1.清洗清洗E.coliS17-1(pSET152),以除去残留的抗生素。
),以除去残留的抗生素。
每每组组同同学学取取1支支装装有有1ml浓浓缩缩的的E.coliS17-1(pSET152),用用无无菌菌水水清清洗洗。
先先将将1ml的的菌菌液液用用12000rpm/min,离离心心1min,然然后后迅迅速速到到超超净净工工作作台台倒倒去去上上清清液液。
加加入入1ml的的无无菌菌水水,在在振振荡荡器器上上将将菌菌体体打打散散混混匀匀后后,同同样样用用12000rpm/min,离离心心1min。
重复以上操作三次,最后将菌体用。
重复以上操作三次,最后将菌体用1ml的无菌水悬浮。
的无菌水悬浮。
2.孢子孢子每每组组同同学学拿拿一一支支准准备备好好的的孢孢子子放放入入50水水浴浴锅锅进进行行热热激激处处理理10min。
然然后后转转入入37水水浴浴温温浴浴培培养养0.5-1小小时时(预预萌萌发发)。
将将预预萌萌发发好好的的孢孢子子用用LB培培养养基基清清洗洗三三次次,最最后后用用100ulLB悬悬浮。
预萌发过程每四组找一个同学倒平板。
浮。
第第一一、三三、五五、七七组组的的第第一一个个同同学学融融化化1瓶瓶250ml的的培培养养基基,倒平板倒平板10-11皿,供皿,供8个同学使用。
个同学使用。
3.每每组组同同学学取取100ul的的E.coliS17-1/pSET152细细胞胞和和100ul预预萌萌发发好好的的链链霉霉菌菌孢孢子子混混合合均均匀匀,静静置置5min左左右右,再再将将混混合合液液涂涂M-ISP4平平板板。
同同时时将将没没有有同同E.coliS17-1/pSET152混混合合的的100ul的的孢孢子子涂涂在在另另一一个个M-ISP4平平板板上上,作作为为阴阴性性对对照。
照。
4.将将平平板板送送去去30培培养养箱箱恒恒温温培培养养16-22个个小小时时(至至第第二二天天早上)早上)操作步骤(第二天)5.用用阿阿伯伯拉拉抗抗生生素素和和萘萘啶啶酮酮酸酸混混合合液液对对接接合合转转移移平平板板进进行行覆覆盖进行覆盖盖进行覆盖.将将600ul的的Apr(阿阿伯伯拉拉抗抗生生素素)和和600ul的的Nalidixicacid(萘萘啶啶酮酮酸酸)溶溶液液混混合合在在一一只只1.5ml的的EP管管中中。
然然后后将将混混合好的溶液均匀地涂布在接合转移平板上。
合好的溶液均匀地涂布在接合转移平板上。
6.将平板在超净工作台吹干后,放于将平板在超净工作台吹干后,放于30培养箱培养。
培养箱培养。
7.约约3-5天后(下一次实验时)观察接合转移子。
天后(下一次实验时)观察接合转移子。
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