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白喉外毒素免疫动物抗毒素治白喉Behring(德,18541917)4目前治疗性抗体产品:
精制破伤风毒目前治疗性抗体产品:
精制破伤风毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。
素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。
绿脓免疫血浆抗体制剂绿脓免疫血浆抗体制剂5多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备n根据不同的免疫原,选择不同的免疫方案。
n免疫方案免疫途径免疫程序动物选择6细胞融合细胞融合,又称体细胞杂交是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。
在适当的条件下,细胞融合在一起,产生具有在适当的条件下,细胞融合在一起,产生具有原来原来两个细胞基因信息的单个核细胞两个细胞基因信息的单个核细胞,称为,称为杂交细胞杂交细胞(hybridcell)。
)。
2、细胞融合技术和单克隆抗体、细胞融合技术和单克隆抗体7显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程8uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。
uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。
uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。
uLange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞发生融合的过程。
uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。
u1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。
u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。
u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
u20世纪80年代出现了电融合技术。
细胞融合研究进展细胞融合研究进展9n19751975年,年,KohlerKohler和和MilsteinMilstein应用应用小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞和绵羊细胞致敏和绵羊细胞致敏的小鼠的小鼠脾细胞脾细胞融合,得到的一部融合,得到的一部分融合杂交细胞既能继续生长,分融合杂交细胞既能继续生长,又能分泌抗羊红细胞抗体,将这又能分泌抗羊红细胞抗体,将这种杂交细胞系统称为杂交瘤细胞,种杂交细胞系统称为杂交瘤细胞,应用这种方法可制备单一抗原决应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体。
定簇的单克隆抗体。
10一、何谓单克隆抗体?
一、何谓单克隆抗体?
11由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆细胞克隆产生的同源抗体,称单克隆抗体产生的同源抗体,称单克隆抗体12131415单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与与经特定抗源免疫刺激的经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell),杂交瘤,杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖,又具有细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖,又具有B淋巴细淋巴细胞产生特异性抗体的能力。
因此,单克隆抗体技术又称为杂胞产生特异性抗体的能力。
因此,单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术交瘤技术(hybridomatechnology)。
16NielsK.JerneG.KohlerC.Milstein17杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理1833、基因工程抗体、基因工程抗体基因工程抗体即将抗体的基因按不基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配,同需要进行加工、改造和重新装配,然后导入适当的受体细胞中进行表然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。
达的抗体分子。
19基因工程抗体与单克隆抗体相比的优点:
基因工程抗体与单克隆抗体相比的优点:
通过基因工程技术的改造,可以通过基因工程技术的改造,可以降低降低甚至消除甚至消除人体对抗体的排斥反应。
人体对抗体的排斥反应。
基因工程抗体的分子量较小,可以基因工程抗体的分子量较小,可以部部分降低抗体的鼠源性分降低抗体的鼠源性,更有利于穿透,更有利于穿透血管壁,进入病灶的核心部位;
根据血管壁,进入病灶的核心部位;
根据治疗的需要,制备新型抗体。
治疗的需要,制备新型抗体。
可以采用原核细胞、真核细胞和植物可以采用原核细胞、真核细胞和植物等等多种表达方式多种表达方式,大量表达抗体分子,大量表达抗体分子,大大降低生产成本。
大大降低生产成本。
20整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体(抗血清)多克隆抗体(抗血清)单克隆抗体单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体小型化抗体”(单链抗体)(单链抗体)组合抗体库技术组合抗体库技术噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术IgIg基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术21经过免疫的哺乳类动物经过免疫的哺乳类动物单一的单一的BB淋淋巴细胞巴细胞,可以合成分泌单一性的抗,可以合成分泌单一性的抗体,我们称这种具有体,我们称这种具有特异性特异性的的、同、同质性质性的抗体为单克隆抗体。
的抗体为单克隆抗体。
二、二、McAbMcAb技术基本原理技术基本原理22改变改变B淋巴细胞遗传特性淋巴细胞遗传特性建立建立永久生长永久生长和和能分泌能分泌McAb细胞系的途径细胞系的途径病毒转化病毒转化细胞杂交细胞杂交23骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型(型(HGPRT-)胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)24*融合细胞的选择原理ll1964年Litterlefield首先发明HAT选择性培养基。
H:
Hypoanthine次黄嘌呤A:
Aminopterin氨基喋呤T:
Thymidine胸腺嘧啶脱氧核苷原理:
正常细胞不但具有利用培养液中的谷酰胺和尿核苷单磷酸合成DNA的能力,且当这条主要途径被氨基喋呤(A)阻断时,还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶脱氧核苷(T)在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的作用下,借此替代通路来合成DNA的能力。
25三、三、McAb技术的特点技术的特点1、高度特异性高度特异性2、高度稳定性、高度稳定性3、高抗体活性、高抗体活性44、不可知性不可知性55、过于单一性过于单一性26四四、McAMcA制备的基本方法制备的基本方法
(一)一)抗原提纯与动物免疫抗原提纯与动物免疫27
(二)
(二)骨髓瘤细胞及饲养细胞骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备的制备n对数生长期的骨髓瘤细胞SP20(HGPRT缺陷株)的准备n脾细胞的准备28融合前骨髓瘤细胞:
细胞状态浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布29(三)(三)细胞融合细胞融合n融合过程须注意问题融合过程须注意问题n11、细胞比例:
、细胞比例:
骨髓瘤细胞与脾细胞比例为1:
4n22、反应时间:
、反应时间:
混合细胞的离心管中30s内加入1ml37预温的50PEG,边加边轻轻摇动离心管,作用90s,然后加入预温的37的DMEM不完全培养液终止PEG作用,800r/min离心6min,弃上清。
n33、培养液成分、培养液成分30(四)筛选和克隆(四)筛选和克隆有限稀释法有限稀释法(稀释至稀释至0.80.8个细胞个细胞/孔孔)(五)(五)单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的制备和冻存(六)(六)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化(制备方法:
体内培养、体外培养)(制备方法:
体内培养、体外培养)(盐析、凝胶过滤、离子交换层析、(盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、酸沉淀)亲和层析、酸沉淀)31四四、McAMcA制备的基本方法制备的基本方法32五五、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用11、作为亲合层析的配体、作为亲合层析的配体22、作为生物治疗的导向武器作为生物治疗的导向武器33、作为免疫抑制剂作为免疫抑制剂通过亲和层析可从复杂的混合物中通过亲和层析可从复杂的混合物中分离、纯化某一特定成分分离、纯化某一特定成分McAbMcAb所带药物只作用于靶组织器官所带药物只作用于靶组织器官抗人的抗人的TT淋巴细胞单抗用于临床治疗自身淋巴细胞单抗用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应免疫疾病和抗器官移植的排斥反应3344、作为研究工作中的探针、作为研究工作中的探针55、增强抗原的免疫原性、增强抗原的免疫原性66、作为医学检验试剂、作为医学检验试剂(11)诊断各类病原体)诊断各类病原体(22)肿瘤特异性抗原和相关抗原检测)肿瘤特异性抗原和相关抗原检测(33)检测淋巴细胞表面标志)检测淋巴细胞表面标志(44)机体微量成分的测定)机体微量成分的测定34CJPEB1CJPEB1重组蛋白的表达及重组蛋白的表达及单克隆单克隆/多克隆抗体的制备鉴定多克隆抗体的制备鉴定35课题的思路及目的课题的思路及目的诱导培养基因工程菌E.coliBL21(DE3)高效表达CJPEB1重组蛋白镍琼脂糖层析柱纯化表达后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠制备单抗免疫新西兰兔制备多抗为建立血清学方法检测CJ创造条件36一、SDS-PAGE鉴定纯化后的PEB1蛋白123456M78910123456M78910图图1.SDS1.SDSPAGEPAGE鉴定纯化后的鉴定纯化后的PEB1PEB1蛋白蛋白表达的蛋白通过表达的蛋白通过镍琼脂糖凝胶层镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后,经析柱纯化后,经SDS-PAGESDS-PAGE鉴定,鉴定,蛋白质分子量大蛋白质分子量大小与预计的理论小与预计的理论值相符,和本室值相符,和本室前期的研究结果前期的研究结果一致,一致,PEB1PEB1重组重组蛋白纯度高蛋白纯度高。
1122:
咪唑浓度为:
咪唑浓度为50mmol/L50mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白3344:
咪唑浓度为100mmol/L100mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白5566:
咪唑浓度为200mmol/L200mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白MM:
蛋白质标准分子量:
蛋白质标准分子量778:
8:
咪唑浓度为咪唑浓度为300mmol/L300mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白9910:
10:
咪唑浓度为咪唑浓度为400mmol/L400mmol/L时洗脱的蛋白时洗脱的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd37PEB1PEB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定蛋白单克隆抗体的制备及鉴定常规免疫常规免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体小鼠制备单克隆抗体38-aa-bb-cc-dd-a-b-c-d抗原抗原决决定定簇簇BALB/BALB/CCaabbbbccdd脾脾脏产生各种脏产生各种BB細胞細胞与佐剂乳化与佐剂乳化免免疫疫采采血血收集收集血清血清作为筛选时阳性对照作为筛选时阳性对照无菌取无菌取脾脾脏脏收集收集BB细细胞胞抗原通常有多抗原通常有多个个抗原抗原决决定定簇簇免免疫疫后后
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