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该方法结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作,操作简单,无需产物的后处理,能最大程度地避免扩增产物的污染。
表1ARMS法与测序法比较测序法测序法ARMS法法敏感度10-20%1%FFPE标本成功率低高商用试剂盒无有流程与速度复杂慢简单快数据分析要求高低试剂成本低略高仪器成本高低假阳性机会(交叉污染)多少其中ARMS检测可以分为实时荧光定量PCR和巢式ARMS法电泳检测。
实时荧光定量PCRARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大,与此同时,利用探针对扩增产物进行检测,在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测,以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。
该技术所用探针为Scorpion探针,Scorpion探针是一种新型的探针,由一条发夹结构的探针和一条引物构成,探针的5端和3端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3端通过PCRblocker(一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸)与引物的5端相连。
在自由状态,报告荧光和淬灭荧光很接近,不产生荧光。
变性阶段茎环结构打开,退火时引物与模板结合并延伸,环区与新合成的目的基因的互补区域结合,此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上,是分子内的结合。
由于发夹结构打开,报告荧光和淬灭荧光分离,因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。
由于Scorpion探针中序列特异性引物和探针在同一分子上,因此信号的产生特别快。
巢式ARMS法电泳检测利用PCR引物的3端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,设计等位基因特异性PCR扩增引物,在严格的条件下,只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带,从而检测出突变,该法省去了探针杂交操作。
基本原理在PCR扩增时,引物的延伸是从其3未端开始的,而这种延伸的进行要求引物3端的碱基与模板需完全配对,只有这样引物才能延伸,扩增才得以进行下去而得到预期的扩增产物,若引物3端与模板不能配对,则引物的延伸即阻断,不能得到相对应的扩增产物,基于以上事实,可利用3端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的突变位点,此即3特异PCR,扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个PCR扩增反应,有两对引物但它们的3端有差异,一为正常引物,另一为3端编食突变的引物,正常引物只与正常模板互解,PCR时扩增相应的产物,而食突变的引物只与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结果。
碱基配合、或错配,决定PCR能不能进行PCR产物一边长,而另一边短,通过电泳,就可以方便地确定哪一边扩出来了,就是碱基配合的;
反之,没有扩出来的,那一边引物的最后一个碱基是错配的2组对称的实验,把最终的SNP型确定下来。
利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子,而且能检出杂合子个体,在这种情况下,同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应.尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3-特异PCR,可攻DNA分子上的多位点变化的鉴定准确快速,简便。
应用目前利用ARMS法研发用于临床的试剂盒有:
人KRAS基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法)本试剂盒用于检测大肠癌患者癌组织中KRAS基因的热点突变情况,可定性检测KRAS基因外显子2中第12密码子(G12D(35GA)、G12A(35GC)、G12V(35GT)和13密码子(G13D(38GA)的四个热点突变位点。
ARMS-PCR法四项耳聋基因检测试剂盒近日,中生北控生物科技股份有限公司分子诊断试剂研发部开发的ARMS-PCR法四项耳聋基因检测试剂盒经中检所检测,顺利通过国家药监部门的审核,获得国家食品药品监督管理局颁发的医疗器械注册证,注册号为:
国食药监械(准)字2012第3400599号。
四项耳聋基因检测试剂盒用于定性检测人血细胞中基因组DNA中与遗传性耳聋相关的3个基因中的4个突变位点,即GJB2基因235delC;
SLC26A4基因IVS7-2AG;
线粒体12SrRNA基因1555AG和1494CT。
这4个位点是中国人最常见的耳聋突变位点。
通过对上述位点的检测,比常规听力筛查的1阳性检出率提高20倍。
四项耳聋基因检测试剂盒检测适应人群为,需要使用氨基糖苷类抗生素的人群、产前筛查、新生儿筛查以及各种不明原因的耳聋人群。
尤其针对每一个新生儿在其成长过程中,使用该产品让父母都能了解自己孩子听力方面内在的优势和劣势,能够做到清楚、科学地应对由于自身基因缺陷而面临的潜在听力危机,通过有效避免不良因素的干扰,保证孩子在一个健康的听力状况下成长。
人KIF5B-RET融合基因检测试剂盒(ARMS-荧光PCR法)本试剂盒用于定性检测非小细胞肺癌等患者KIF5B-RET融合基因7种融合型,产品包含独家稳定剂,在达到1%高灵敏度的前提下,仍可保证高特异性,避免假阳性。
检测结果可供医生在非小细胞肺癌患者中选择适合Ret抑制剂的靶向药物治疗的人群时参考。
检测结果仅可用于临床参考,不可作为诊治的唯一依据。
仅可用于体外检测。
人类BRAF基因突变检测试剂盒(ARMS-荧光PCR法)(广州好芝生物科技有限公司)本试剂盒以石蜡包埋病理切片组织中提取的DNA为检测样本,定性检测肿瘤患者体细胞的BRAF基因V600E突变状态,用于辅助临床甲状腺癌诊断、分型,或对黑色素瘤、结直肠癌的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)和BRAF基因突变靶向药物选用提供参考。
ADx-ARMSPDGFRA基因D842V突变检测试剂盒(厦门艾德生物医药有限公司)PDGFRA基因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体A(Pdgfr-a),为一种单链跨膜糖蛋白,与C-KIT同属III型酪氨酸蛋白激酶家族,且结构相似,两者的氨基酸序列有很高的同源性。
PDGFRA与配体PDGF结合后形成受体配体复合物并活化PDGFRA,从而激活*脂酰肌醇、cAMP及多种蛋白质的*酸化途径,通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核,诱导相应基因表达,促进DNA合成,引起细胞分裂和增殖。
当受体或配体发生异常突变,可导致恶性肿瘤。
人EGFR基因29种突变型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)本检测试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和和检测技术,适合于检测非小细胞肺癌病人血清或血浆、组织样本中的EGFR基因29种常见突变型,该检测试剂盒仅用于科学研究使用。
目前用于科学研究阶段的有:
地贫ARMS法4种常见突变诊断试剂盒该试剂盒应用于产前基因诊断,应用该试剂盒检查了95例地贫的常见突变,获得了满意的结果。
对一个重型地贫家系4例基因型的检测也证明这种检测方法的可行性和可靠性。
ARMS法检测G6PD应用突变特异性扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)检测江西省常见的3种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症突变基因G1376T、G1388A、A95G.方法用ARMS法对40例江西籍经G6PD/6PGD比值证实为G6PD缺乏者进行检测.结果40例江西籍G6PD缺乏者检出G1376T11例(27.5%)、G1388A17例(42.5%)、A95G1例(2.5%).3种突变占40例G6PD缺乏者G6PD突变基因类型72.5%,末定型11例.结论ARMS是一种简单、省时、经济、准确的检测G6PD基因常见突变的方法
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